免疫印跡試驗(yàn)步驟及問題解決

1、免疫印跡實(shí)驗(yàn)步驟及問題解決一、實(shí)驗(yàn)步驟 試劑和緩沖液1x 緩沖液：50,150,0.1% ,0.5% ,1%100 或 401x 緩沖液:137,2.7,2.724,2.724 ,7.4或蛋白分析試劑盒1.5 M 緩沖液 (8.8) : 90.68 g20,500 溶液調(diào)節(jié)到8.81.0 M 緩沖液 (6.8) : 60.58 g20,500 溶液調(diào)節(jié)到6.810% : 100 溶于 120。 用前準(zhǔn)備10% : 10 g 溶于 10020。1x 甘氨酸電泳緩沖液：25，230 甘氨酸 (8.3)，0.1%o3x 蛋白加樣緩沖液：150( 6.8),6%,30%甘油，30 和 0.2%溴酚藍(lán)1

2、x : 25( 7.5) : 0.15 M ,0.05% 20,0.001% 硫柳汞1x 轉(zhuǎn)移緩沖液：3 g ,14.4 g 甘氨酸和 200 甲醇，力口 20 到 1L樣品準(zhǔn)備 細(xì)胞培養(yǎng)樣品貼壁細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用 1X 沖洗去掉殘留培養(yǎng)基加入預(yù)冷的 400 1 1X 緩沖液/100 平皿。在冰上孵育 5-10o完全刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到在冰上預(yù)冷的1.5 離心管中。(可選)充分混勻或超聲處理。4 C 下 12,000 離心 10-15 并收集上清總蛋白用前需儲(chǔ)存在-20 Co懸浮細(xì)胞(可選)取出 100 細(xì)胞培養(yǎng)也進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 或 15 離心管 2000 4 C 離心 5

3、。去除培養(yǎng)基并用 1 預(yù)冷的 1x 重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到1.5 離心管中。20004 C 離心 5。用 1 預(yù)冷的緩沖液/107 細(xì)胞重懸細(xì)胞aranalf?Przts rmgintpiPIP44J4- freMtfK沖沖g畔畔hqi氐口氐口A.-nwirGhECLfn.pS5.3IEB 3T：CEilBJkTH#iJlia I CL*rlmy細(xì)胞懸液在冰上孵育并搖床30，或充分混勻或超聲處理。4 C 12000 離心 10-15 收集上清備用?？偟鞍仔枰谟们皟?chǔ)存在 -20 C。組織組織準(zhǔn)備和定量。將組織切成小塊。加入 500-600 預(yù)冷的 1x 緩沖液/100 組織。將組織充分混勻4 C

4、 12000 離心 15-20。收集上清?？偟鞍自谟们皯?yīng)儲(chǔ)存在-20 Co蛋白定量分析和分析請(qǐng)查看來邦的綜述蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠615%分離膠上注入 5%的濃縮膠并插上梳子（10 或者 15 孔）。分離膠濃度（%）蛋白大小范圍（）825-2001015-10012.510-701512-45204-40表 1 :蛋白分離范圍由分離膠濃度決定。上樣和電泳2X 蛋白上樣緩沖液與蛋白樣品1:1 充分混勻。注膠前先將樣品在 50-60 C 預(yù)熱。預(yù)染可用于監(jiān)控蛋白分離和轉(zhuǎn)移效率。 在 1X 甘氨酸緩沖液在60-120V 跑電泳 1-3 小時(shí)分離膠（10）濃縮膠（3）6%8%10%12%15%6%H

5、205.34.64.03.32.32.130% 丙烯酰胺 混合物*2.02.73.34.05.00.51.5M(8.8)2.52.52.52.52.51.0M(6.8)0.3810%0.10.10.10.10.10.0310%0.10.10.1.10.10.030.0080.0060.0040.0040.0040.003表 2:分離膠（10）和濃縮膠（3）的制備方案蛋白轉(zhuǎn)移 將蛋白轉(zhuǎn)移到或 * 膜上進(jìn)行抗體檢測(cè) 1.將電泳材料，如膠、紙和海綿放入1X 轉(zhuǎn)移緩沖液中預(yù)先浸潤 .2 膜應(yīng)在甲醇中預(yù)先孵育 10 秒到 1 分鐘，然后移入轉(zhuǎn)移緩沖液中3.將材料按如下順序放置 :板（黑色面） ， 海綿，

6、 紙， 膠， 膜， 紙， 海綿， 板（亮面）4.將轉(zhuǎn)移裝置安置好，黑色面對(duì)應(yīng)黑色電極。5.轉(zhuǎn)移到冷的 1X 轉(zhuǎn)移緩沖液中 .電轉(zhuǎn)電流和時(shí)間應(yīng)該根據(jù)電泳裝置的廠家說明推薦設(shè)置。* 膜不能用甲醇孵育。將膜放入溶有 5%脫脂奶粉的 1x 中 25 C 孵育 1 小時(shí)（或在搖床上 4 C 孵育過夜）。 抗體孵育1.按照推薦濃度或根據(jù)結(jié)果優(yōu)化濃度，將一抗溶于1X 3% 中。2在 4 C 孵育過夜或更長時(shí)間，或者在室溫下4 小時(shí)。3.回收一抗，保存在 4 C。然后在室溫下在搖床上沖洗膜二次，每次5-10。4將二抗放入 1X 中稀釋，然后室溫下孵育膜1 小時(shí)，或 4 C 搖床上 2-4 小時(shí)。5.在室溫?fù)u床

7、上用洗二次，每次 10系統(tǒng)和膠卷被用于標(biāo)記的二抗。二、問題解決 沒有信號(hào)，可能原因 檢測(cè)的二抗用錯(cuò)了（明確一抗制備的宿主） 一抗或二抗的濃度太低（提高濃度再試一次） 一抗不能識(shí)別檢測(cè)物種的蛋白（檢查一抗的特異性） 上樣蛋白量太少（增加樣品的量） 轉(zhuǎn)移效率太低（改進(jìn)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)步驟。確保膜用之前用甲醇預(yù)孵育） 一抗已經(jīng)被用很多次了（使用重新稀釋的一抗） 封閉時(shí)間太長或者洗滌次數(shù)太多（減少封閉時(shí)間和洗滌次數(shù)） 檢測(cè)試劑盒失效 （加入陽性對(duì)照并確保試劑盒有效）疊氮化鈉可能抑制二抗 （溶解緩沖液中應(yīng)避免使用疊氮化鈉）一抗或二抗的孵育時(shí)間太短（延長孵育時(shí)間）背景太亮 封閉時(shí)間太短或者封閉緩沖液有問題（延長封

8、閉時(shí)間或者用代替脫脂奶粉）。一抗或二抗?jié)舛忍摺?（降低抗體濃度）洗脫不充分（增加洗脫次數(shù)）孵育溫度太高（確保一抗在 4 C 孵育）膜使用錯(cuò)誤或者膜已經(jīng)干了 （避免膜變干）白色條帶或者信號(hào)消失很快 一抗或二抗?jié)舛忍撸ń档涂贵w濃度）條帶彎曲電泳電壓太高， 或者電泳過程中緩沖液溫度太高。 （降低電壓， 電泳緩沖液置于冷的環(huán)境中） 條帶彌散 一抗或二抗?jié)舛忍撸ń档涂贵w濃度） 上樣蛋白量太大 （降低上樣量）空白區(qū)域 轉(zhuǎn)移不均衡（確保膜均衡的貼到膠上，沒有氣泡） 非特異性信號(hào)一抗或二抗?jié)舛忍撸ń档涂贵w濃度）條帶臟或者模糊 平衡時(shí)間不夠，或者膠與膜的接觸不均衡。 （確保膠沒問題，改進(jìn)轉(zhuǎn)移步驟）禿斑 膠與膜之間有氣泡（確保膠與膜之間沒有氣泡）條帶大小與理論不符 一抗特異性差（更換一抗） 一些