體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢驗方法驗證方案.

1、編號頁數(shù)1/18體外培育牛黃中膽酸、 去氧安琪酵母股份有限膽酸含量檢驗方法驗證方制訂部門技質(zhì)部公司藥業(yè)分公司案頒發(fā)部門技質(zhì)部生效日期：年月日文件目錄一、 概述2二、 目的2三、 范圍2四、 職責2五、 驗證內(nèi)容2六、 驗證實施8七、驗證進度安排12八、偏差處理及報告匯總12九、驗證結(jié)果評定與結(jié)論12十、附件12你的簽名表明你已清楚了解本文件及附件內(nèi)容，充分理解并認可本文件的所有條款。起草人審核人審核人QA審閱批準人批準人部門簽名日期中心化驗室中心化驗室技質(zhì)部技質(zhì)部生產(chǎn)管理負責人質(zhì)量管理負責人本文件根據(jù)需要應分發(fā)于以下部門：生產(chǎn)部辦公室調(diào)度室制劑車間技質(zhì)部原料藥車間機修車間中心化驗室倉儲檔案室安

2、琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)2/18一、 概述2015 版中國藥典收錄的體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢測使用的是薄層色譜法，此方法因其精密度不能滿足要求且方法落后， 無法滿足檢測要求， 故變更為高效液相色譜法進行檢測。二、 目的建立體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量的高效液相色譜法檢測的方法驗證三、 范圍中心化驗室四、 職責1、驗證委員會1.1負責驗證管理的日常工作及公司內(nèi)驗證工作總的調(diào)度、協(xié)調(diào)及總結(jié)工作；1.2負責驗證任務的下達及驗證小組的確定；1.3負責驗證計劃和驗證方案審核和批準工作；1.4負責驗證報告的評價工作；1.5負責驗證周

3、期的確定工作；1.6負責發(fā)放驗證證書；2、技術(shù)質(zhì)量管理部職責2.1負責對驗證方案和報告的可行性的審核；3、驗證小組職責3.1負責驗證方案起草，并對批準后的驗證方案組織實施；3.2負責驗證全過程管理并收集、整理驗證數(shù)椐；3.3負責總結(jié)、寫出驗證報告；3.4負責驗證實施過程中的檢測，并出具檢測報告；3.5 驗證小組人員小組職務姓名所在部門職務組長中心化驗室組員中心化驗室組員中心化驗室五、 驗證內(nèi)容安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)3/181、驗證依據(jù)、驗證標準：中華人民共和國藥典2015 年版2、驗證判斷標準：準確度 :6 份樣品的平均回收率限度

4、達到： 95-102% 精密度 :6 份對照品峰面積的重復性（ RSD）達到 1.5%專屬性 : 將樣品分別置于高溫、高濕、酸堿水解、氧化降解、強光照射進行加速破壞，再測定其含量檢測限：將檢測限數(shù)據(jù)使用含量相近的樣品進行驗證，附圖譜及結(jié)果定量限：將定量限數(shù)據(jù)使用含量相近的樣品進行驗證，附圖譜及結(jié)果，應符合準確度、精密度要求。線性：應有回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性圖范圍：對 80%-120%供試品溶液濃度的供試液測得的含量應符合準確度、精密度要求。耐用性： 12 小時內(nèi)分別測得的樣品含量的 RSD應達到 1.5% 3、人員查閱人員檔案，確認已經(jīng)對有關(guān)操作人員進行了相關(guān)培訓，見下表1：（一）人員培訓確

5、認記錄人 員培訓內(nèi)容檢查結(jié)果中華人民共和國藥典2015 年版、體外培育檢驗人員牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢驗方法驗證方案（二）人員檔案姓 名學歷職位入廠時間培 訓結(jié) 論是否符合要求不符合要求是否符合要求不符合要求是否符合要求不符合要求是否符合要求不符合要求是否符合要求不符合要求檢查人：日期：確認人：日期：4、驗證用文件文件編號文件名稱體外培育牛黃中膽酸、 去氧膽酸含量檢驗方存放位置安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)4/18法驗證方案檢查人：日期：確認人：日期：5、實驗室環(huán)境項目可接受標準結(jié)果結(jié)論溫度1826符合要求不符合要求濕度4565%符合要

6、求不符合要求其他干凈、整潔符合要求不符合要求6、實驗試劑及儀器：試劑膽酸對照品去氧膽酸對照品甲醇甲酸乙腈鹽酸氫氧化鈉雙氧水批號：生產(chǎn)廠家：級別 結(jié)論符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求檢查人：儀器日期：型號確認人：編號日期：校驗有效期結(jié)論電子天平符合要求不符合要求高效液相色譜儀符合要求不符合要求電熱鼓風干燥箱符合要求不符合要求檢查人：7、實驗樣品 :檢查人：8、驗證內(nèi)容及結(jié)果8.1 對照品溶液的制備日期：日期：批號：確認人：確認人：日期：生產(chǎn)廠家日期：取對膽酸、去氧膽酸對照品適量，精密稱

7、定，加甲醇制成含膽酸240ug/ml和去氧膽酸安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)5/1880ug/ml 的混合溶液，即得。8.2 供試品溶液制備取樣品適量，研細，取約 50mg，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇 50ml，稱重，超聲處理 30min，用甲醇補足減失的重量，搖勻， 0.45um 濾膜濾過即得。8.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱： Wondasil C18(4.6mm*250mm，5um)；柱溫：25；以 0.2%甲酸溶液（ A）- 乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（ 07min， 5%B； 715min,5%B 80%B；1

8、520min， 80%B90%B；2023min90%B96%B）；流速：1.0ml/min ；用蒸發(fā)光散射檢測器； 氮氣流速：2.3ml/min ，漂移管溫度 110。樣品中各色譜峰分離度大于 1.5 ，理論板數(shù)按膽酸峰計算應不低于 5000。8.4 線性關(guān)系考察2ml、 4ml、6ml、8ml、 10ml，分別置于 10ml 容量瓶中，用甲醇定容精密量取對照品溶液到刻度，得到膽酸濃度分別為48、 96、144、192、 240ug/ml ；去氧膽酸濃度分別為 16、32、48、64、80ug/ml 。精密吸取各級對照品溶液 10ul注入液相色譜儀測定峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，

9、繪制標準曲線?；貧w方程：相關(guān)系數(shù)膽酸去氧膽酸結(jié)論：檢查人：日期：確認人：日期：8.5 供試品測定法取供試品溶液 10ul 注入液相色譜儀，依法測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品溶液中膽酸、去氧膽酸的含量，計算，即得。8.6 、精密度取同對照品溶液 10ul 連續(xù)進樣 6 次，測定峰面積，計算膽酸和去氧膽酸峰面積的 RSD 膽酸：峰面積RSD123456安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)6/18去氧膽酸：峰面積RSD123456結(jié)論：檢查人：日期：確認人：日期：8.7耐用性取供試品 10ul ，分別于 0、2、4、6、8、10、 12h 進樣，

10、依法測定峰面積，計算得到膽酸和去氧膽酸的平均含量、RSD供試品稱樣量：膽酸：時間（ h）峰面積溶液濃度（ug/ml ） 稀釋倍數(shù)測定結(jié)果024681012RSD去氧膽酸：時間（ h）峰面積溶液濃度稀釋倍數(shù)測定結(jié)果（ ug/ml ）02安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)7/184681012RSD結(jié)論：檢查人：日期：確認人：日期：8.8 準確度取已知膽酸和去氧膽酸含量的樣品溶液6 份，每份約 25mg。精密稱定，置于錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液10ml，再精密加入甲醇 40ml，稱重，超聲處理 30min，甲醇補足減失的重量，濾過，分別取

11、10ul 注入液相色譜儀，依法測定，計算膽酸和去氧膽酸的平均回收率（ n=6）膽 酸 膽酸濃度 去氧膽峰 面 （ ug/ml ） 酸峰面積 積去氧膽酸稀釋倍濃 度 數(shù)（ug/ml ）膽酸膽酸去氧去氧含量回收膽酸膽酸率含量回收率123456膽酸平均回收率：去氧膽酸平均回收率：結(jié)論：檢查人：8.9 檢測限與定量限日期：確認人：日期：安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)8/18限；以信噪比10:1 時的進樣量為定量限，測處膽酸和去氧膽酸的定量限。并用含量相近的樣品進行驗證檢測限與定量限，其中定量限要包括準確度（8.7 ）和精密度（ 8.5 ）實驗。檢

12、測限圖譜：檢測限相似濃度樣品圖譜：定量限圖譜：定量限相濃度樣品圖譜：定量限相濃度樣品準確度：膽膽酸去去氧稀膽膽去去酸峰濃度氧膽酸膽酸濃度釋倍數(shù)酸含酸回氧膽氧膽面積（ ug/ml ）峰面積（ug/ml ）量收率酸 含酸 回量收率123456膽酸平均回收率：去氧膽酸平均回收率：定量限相濃度樣品精密度（取樣品溶液10ul ）：膽酸：峰面積RSD12安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)9/183456去氧膽酸：峰面積RSD123456結(jié)論：檢查人：日期：確認人：日期：8.10 范圍取樣品適量， 研細，分別取約 40mg、60mg，精密稱定，置于錐形瓶中

13、， 精密加入甲醇 50ml，稱重，超聲處理 30min，用甲醇補足減失的重量， 搖勻， 0.45um 濾膜濾過，即得 80%、120%濃度的供試品，共制得供試品 6 份。按照 8.5 進行測定，應符合準確度、精密度要求。80%濃度供試品準確度：膽膽 酸去酸峰濃度氧膽酸面積（ ug/ml ）峰面積123456膽酸平均回收率：去 氧稀膽膽去去膽酸濃度釋倍數(shù)酸 含酸 回氧 膽氧 膽（ug/ml ）量收率酸 含酸 回量收率去氧膽酸平均回收率：安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)10/1880%濃度供試品精密度（取供試品10ul ）膽酸：峰面積RSD12

14、3456去氧膽酸：峰面積RSD12345620%濃度供試品準確度：膽 酸膽酸濃度去氧膽去氧膽酸稀 釋 倍膽 酸膽 酸去 氧去 氧峰 面（ ug/ml ）酸峰面濃度數(shù)含量回 收膽 酸膽 酸積積（ug/ml ）率含量回 收率123456膽酸平均回收率：去氧膽酸平均回收率：20%濃度供試品精密度（取供試品10ul ）膽酸：安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)11/18峰面積RSD123456去氧膽酸：峰面積RSD123456結(jié)論：檢查人：日期：確認人：日期：8.11 專屬性8.11.1酸降解試驗稱取研細樣品 50mg于 50ml 容量瓶中，加 0.1

15、mol/l的鹽酸 2ml 溶解，超聲 4 小時后用甲醇定容，再超聲處理30min，搖勻， 0.45um 濾膜濾過得供試品按照 8.5 測定。8.11.2堿降解試驗稱取研細樣品50m于 50ml 容量瓶中，加 0.1mol/l的氫氧化鈉 2ml 溶解，超聲 4 小時后用甲醇定容，再超聲處理30min，搖勻， 0.45um 濾膜濾過得供試品按照 8.5測定。8.11.3氧化降解試驗稱取研細樣品 50mg于 50ml 容量瓶中，加 5%的雙氧水 2ml 溶解，超聲 4小時后用甲醇定容，再超聲處理 30min，搖勻， 0.45um 濾膜濾過得供試品按照 8.5 測定。8.11.4高溫降價將樣品存放在

16、130烘箱中考察 8 個小時，取約 50mg，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇適量 50ml，稱重，超聲處理 30min，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾 0.45um 濾膜濾過得供試品按照 8.5 測定。8.11.5 高濕降價將樣品適量存放在相對濕度 92.5%，25（取干燥器，放入硝酸鉀飽和溶液） ，考察 5 天，取約 50mg，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇 50ml，稱重，超聲處理 30min，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾 0.45um 濾膜濾過得供試品按照 8.5 測定。8.11.6 光降解試驗將樣品適量置于 4500LX照度下照射 15 天，取約 50mg，精密稱定，置于

17、錐形瓶中，精密加入甲醇適量 50ml，稱重，超聲處理 30min，用甲醇補足減失的重量， 搖勻，濾 0.45um安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)12/18濾膜濾過得供試品按照8.5 測定。條件稱重（ mg）峰面積溶液濃度稀釋倍數(shù)測定結(jié)果（ ug/ml ）酸降解堿降解氧化降解高溫降解高濕降解光降解結(jié)論：檢查人：日期：確認人：日期：六、驗證實施1、驗證開始前， 應組織驗證小組成員進行培訓， 培訓內(nèi)容主要為：體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢驗方法驗證方案 。人員培訓情況見附件 1：人員培訓記錄。2、驗證過程中， 如果需要修改或完善驗證方案，應報

18、驗證委員會審批， 審批記錄見附件2：驗證方案修改申請及批準書七、驗證進度安排1、驗證進度安排： 2016 年月日至 2016 年月日八、偏差處理及報告匯總所有偏差的糾正，必需得到QA的批準。收集所有的偏差報告，對偏差報告進行匯總，在批準最終驗證報告之前，所有偏差應得到 QA的批準。偏差處理情況見附件3：偏差處理記錄偏差報告匯總見附件4：偏差報告匯總表九、驗證結(jié)果評定與結(jié)論1、驗證小組負責收集各項驗證、試驗結(jié)果記錄，根據(jù)驗證、試驗結(jié)果起草驗證報告，驗證報告見：體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢驗方法驗證方案 。2、驗證委員會對驗證報告進行綜合評審，做出驗證結(jié)論。如果驗證通過，則發(fā)放驗證證書，見附件 5：驗證證書。十、附件附件 1：人員培訓記錄安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司藥業(yè)分公司量檢驗方法驗證方案頁數(shù)13/18附件 2：驗證方案修改申請及批準書附件 3：偏差處理記錄附件 4：偏差報告匯總表附件 5：驗證證書附件 1：安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號司