分枝桿菌計(jì)數(shù)方法的比較研究

1、分枝桿菌計(jì)數(shù)方法的比較研究    #e#                  作者：羅泰來(lái)，申亮亮，柏銀蘭，薛瑩 【關(guān)鍵詞】  紫外分光光度計(jì)法；濕重法；平板菌落計(jì)數(shù)法；標(biāo)準(zhǔn)曲線；牡牛分枝桿菌Comparative study of Mycobacterium counting methods   【Abstract】 AIM: To build up a f

2、ast counting method for Mycobacterium vaccae (M. vaccae). METHODS: We counted M. vaccae by UV spectrophotometry, wet weight measurement and plate count method, and built up two standard curves. One was drawn according to the results of UV spectrophotometry to plate count and the other was humid weig

3、ht to plate count. RESULTS: We built up two standard curves with the results of UV spectrophotometry and wet weight, to plate count, respectively. The analysis of accuracy rating proved that there was an approximal linear correlation between the two standard curves ranging from 105/mL to 108/mL. CON

4、CLUSION: The method is  dependable, and can be used for quick counting of M. vaccae. 【Keywords】 UV spectrophotometry; wet weight measurement; plate count; standard curve; Mycobacterium vaccae【摘要】 目的： 建立牡牛分枝桿菌的快速檢測(cè)方法.  方法： 采用紫外分光光度計(jì)法、測(cè)濕重法、平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌數(shù)，建立紫外分光光度計(jì)法、測(cè)濕重法對(duì)平板菌落計(jì)數(shù)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線. 結(jié)果： 建立了紫外

5、分光光度計(jì)法和濕重法相對(duì)于平板計(jì)數(shù)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)準(zhǔn)確度分析表明在細(xì)菌含量在每毫升105108之間時(shí)，兩標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好. 結(jié)論： 該方法可用于牡牛分枝桿菌的快速計(jì)數(shù). 【關(guān)鍵詞】 紫外分光光度計(jì)法；濕重法；平板菌落計(jì)數(shù)法；標(biāo)準(zhǔn)曲線；牡牛分枝桿菌0引言結(jié)核病目前仍是嚴(yán)重危及全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一. 據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)1，當(dāng)前全球約有20億人受結(jié)核分枝桿菌感染，我國(guó)近5億人感染. 因此，結(jié)核病的研究已成為傳染病研究的熱點(diǎn)之一. 在科研工作中，如進(jìn)行轉(zhuǎn)化、毒株攻擊等時(shí)，需要即時(shí)檢測(cè)細(xì)菌的濃度范圍. 但分支桿菌的生長(zhǎng)較慢，用普通的平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，不能滿足時(shí)效性. 因此，找到一種快速計(jì)數(shù)分支

6、桿菌的方法，將為科研提供極大便利. 牡牛分支桿菌是一種快速生長(zhǎng)型分支桿菌，廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的發(fā)病機(jī)理和疫苗研究中. 本文研究紫外分光光度法、測(cè)濕重法和平板計(jì)數(shù)法間的關(guān)系，繪制紫外分光光度計(jì)法和測(cè)濕重法標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立能快速計(jì)數(shù)的方法. 1材料和方法1.1材料紫外分光光度儀（JENWAY 6405 UV/Uis Spectorophotometer）、電子天平，離心機(jī)（eppendorf centrifuge 5415 D）, 牡牛分枝桿菌（由微生物教研室保存）；LB培養(yǎng)基，每200 mL含NaCl 2 g、營(yíng)養(yǎng)粉2 g、酵母提取物2 g，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉3.5 g；7H9培養(yǎng)基（DIFCO）

7、.  1.2方法2結(jié)果2.1吸光度與活菌濃度的關(guān)系本實(shí)驗(yàn)要確定溶質(zhì)濃度即分枝桿菌濃度，與分枝桿菌液體在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值的關(guān)系. 根據(jù)朗伯比爾定律2： A=EcL, A為吸光度值, E為吸光常數(shù)，即厚度為1 cm，溶質(zhì)濃度為1%（mol/mL）時(shí)的吸光度值、L為光程，即光線通過(guò)液體的長(zhǎng)度（比色杯厚度）, c為液體的濃度（mol/mL），本實(shí)驗(yàn)中E為定值， L為比色杯厚度為1 cm. 因此，吸光度值A(chǔ)與濃度c成正比關(guān)系，斜率為EL. 得出E值，即可得牡牛分枝桿菌菌液吸光度值與濃度的關(guān)系式. 在一般科研中，所用分枝桿菌菌液為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的菌液. 處于此期的細(xì)菌，活菌量遠(yuǎn)大于死菌

8、量，故可近似認(rèn)為菌液的濃度即為活菌濃度.      對(duì)同一菌液同時(shí)測(cè)吸光度值與進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，將平板菌落計(jì)數(shù)所得菌液濃度作為細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)濃度c. 根據(jù)所測(cè)出A值以及相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度c值，通過(guò)公式A=EcL可算出E值. 重復(fù)測(cè)量，得出多組E值，取平均值即為最終E值. 本試驗(yàn)測(cè)出E值為2.73×10-9. 由上所得E值，可得吸光度與活菌濃度關(guān)系式為A=2.73×10-9×c . 由于斜率過(guò)小，不方便作圖，因此，將濃度c進(jìn)行數(shù)學(xué)變換，以方便作圖. 令x=lgc，y=A，則y=2.73×10-9×

9、;10x（圖1）. 圖1吸光度與細(xì)菌濃度對(duì)數(shù)的關(guān)系略2.2濕重與活菌濃度的關(guān)系從理論上講，細(xì)菌濕重=單個(gè)菌重量×（活菌量+死菌量）未除盡液體重量.   在離心收集細(xì)菌的時(shí)候，盡量除凈液體，并采用相同的操作步驟，使所含微量液體盡量相同，則可近似認(rèn)為濕重與活菌量成線性關(guān)系，即濕重=單個(gè)菌重量×活菌量. 根據(jù)所測(cè)濕重及活菌量，算出單個(gè)分枝桿菌的重量. 本試驗(yàn)測(cè)出的單個(gè)菌重量為8.64×10-12 g. 所得關(guān)系式為M=8.64×10-12×c.  M（g/mL）為單位體積菌液的濕重，c（mol/mL）為菌液濃度. 由于斜

10、率過(guò)小，不方便作圖，故將濃度c進(jìn)行數(shù)學(xué)變換，以方便繪制圖. 令x=lgc，y=M，則得到y(tǒng)關(guān)于x的方程為y=8.64×10-12×10x （圖2）.圖2濕質(zhì)量與細(xì)菌濃度對(duì)數(shù)值的關(guān)系略2.3紫外分光光度計(jì)法準(zhǔn)確度的測(cè)定準(zhǔn)確度可用相對(duì)誤差表示. 按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成分枝桿菌菌液. 由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算測(cè)定值，重復(fù)5次，求出5次測(cè)定值的相對(duì)誤差. 相對(duì)誤差不大于5%，可認(rèn)為準(zhǔn)確. 表1紫外分光光度計(jì)法的準(zhǔn)確度略2.4 兩標(biāo)準(zhǔn)曲線用于繪制分支桿菌生長(zhǎng)曲線為了進(jìn)一步檢驗(yàn)紫外分光光度計(jì)法和濕重法的可行性，我們用這兩種方法分別繪制牡牛分枝桿菌的生長(zhǎng)曲線. 同時(shí)也用平板菌落計(jì)數(shù)法繪制生

11、長(zhǎng)曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，與前述兩曲線進(jìn)行對(duì)比，來(lái)判斷可行性. 按紫外分光光度計(jì)法所述方法，對(duì)牡牛分枝桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，體積為200 mL. 每隔3 h取一次菌液，分別測(cè)量A600值及單位體積的濕重，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出菌液在不同時(shí)間點(diǎn)上的濃度. 同時(shí)用平板菌落計(jì)數(shù)法，測(cè)量每一時(shí)刻的菌液濃度，作為菌液的標(biāo)準(zhǔn)濃度. 將所得所有濃度用圖1所示公式，全部轉(zhuǎn)換成吸光度值，再分別繪制圖形（圖3）. 從圖上可看出，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)曲線所得結(jié)果與用平板菌落計(jì)數(shù)法所得標(biāo)準(zhǔn)濃度，相差不大，可用于對(duì)濃度精度要求不高的科研實(shí)驗(yàn)中.  圖3紫外分光光度計(jì)法、濕質(zhì)量法和平板計(jì)數(shù)法繪制的生長(zhǎng)曲線略3討論關(guān)于分枝桿菌活菌量快

12、速檢測(cè)的方法研究，在國(guó)內(nèi)外均有很大進(jìn)展，方法亦有很多，如：BACTEC快速檢出和非放射自動(dòng)化分析系統(tǒng)3，生物發(fā)光法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)4，熒光素酶報(bào)告噬菌體技術(shù)ILRP5，核酸體外擴(kuò)增法等等6-7. 他們均用于快速檢測(cè)細(xì)菌的濃度，但有些方法如非放射自動(dòng)化分析系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)等，投入太大，儀器設(shè)備價(jià)格太高；有些方法如核酸體外擴(kuò)增法等，操作比較復(fù)雜，需要專門的設(shè)備和技術(shù). 在用分枝桿菌做載體的研究中，經(jīng)常需要即時(shí)了解細(xì)菌的濃度范圍，這就要求建立用現(xiàn)有方法即時(shí)測(cè)定細(xì)菌活菌濃度的標(biāo)準(zhǔn). 本文用紫外分光光度法和濕重法，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線的公式，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明準(zhǔn)確度較高. 用該公式進(jìn)行測(cè)定，表明和金標(biāo)準(zhǔn)

13、的誤差不大，可以根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)要求選擇其中一種或聯(lián)合使用. 通過(guò)多次的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)之后，分枝桿菌活力旺盛，再培養(yǎng)時(shí)，保證充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，則細(xì)菌在進(jìn)入平臺(tái)期之前，細(xì)菌活菌量遠(yuǎn)大于死菌量，從而可以忽略不計(jì)死菌量，認(rèn)為細(xì)菌的活菌濃度等于細(xì)菌濃度. 故可認(rèn)為吸光度值和細(xì)菌活菌濃度之間，以及濕重和活菌濃度之間為正比關(guān)系. 以平板計(jì)數(shù)法為基礎(chǔ)，得出吸光度值、濕重分別與平板計(jì)數(shù)所得活菌濃度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 由于分支桿菌聚集生長(zhǎng)的特性，在測(cè)量吸光度以及在用平板計(jì)數(shù)法測(cè)濃度之前，必須先將聚集的細(xì)菌懸浮，以免對(duì)測(cè)量結(jié)果造成較大誤差. 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)，采用小孔徑注射器充分的吹打菌液8，再用振蕩器振蕩使細(xì)菌充分重懸.

14、 進(jìn)行測(cè)量時(shí)設(shè)置重復(fù)對(duì)照組，將所得結(jié)果取平均值作為最后結(jié)果，可提高準(zhǔn)確度. 由于儀器的靈敏度以及細(xì)菌的生長(zhǎng)特性，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線在濃度為106109間較準(zhǔn)確. 濃度太低，則紫外分光光度計(jì)測(cè)量值偏大，使得濃度偏高；電子天平則很難測(cè)出濕重，無(wú)法進(jìn)行計(jì)數(shù). 因此，本實(shí)驗(yàn)主要根據(jù)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的細(xì)菌計(jì)數(shù)，對(duì)于陳舊培養(yǎng)物的測(cè)定，還需要結(jié)合其他的計(jì)數(shù)方法. 【參考文獻(xiàn)】1 潘希，何國(guó)均.  耐多藥結(jié)核病的研究及進(jìn)展J.  中華結(jié)核與呼吸雜志，2000,23（2）:119-123.2 郝勇.  朗伯比爾定律在定量計(jì)算中的活用J.  數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，1996,9（4）:38

15、3-384.3 Bandak F，Kiaka DL，Setterqutst S，et al. Comparison or Mycobacteria growth indicator tube with BACTEC 460 for detectria and recovery of Mycobacteria from clinical specimensJ.  J Clin Microboil, 1996,34:2 236-2 239.4 唐國(guó)華，何淑雅，賀修勝. 流式細(xì)胞儀每秒進(jìn)樣細(xì)胞數(shù)對(duì)細(xì)胞G0/G1期峰的熒光強(qiáng)度值及變異系數(shù)值的影響J.  中華病理學(xué)雜志，2005，34（12）：816-817.5 劉純杰，王德文. TGF1反義基因及表光熒光素酶的重組腺病毒對(duì)放射性肺纖維化體內(nèi)基因治療初探J.  中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2001，21（4）：282-285.6 陳慶山，劉春燕，劉迎雪，等.  核酸體外擴(kuò)增技術(shù)J. 中國(guó)生物工程雜志， 2004,24（5）:10-14.7 陸宇，朱莉貞，段連山.&#