噻庚啶、山莨菪堿對內(nèi)毒素休克TNFα表達(dá)的影響

1、    噻庚啶、山莨菪堿對內(nèi)毒素休克TNF表達(dá)的影響*        摘要目的：研究噻庚啶山莨菪堿對內(nèi)毒素休克TNF表達(dá)的影響。方法：Wistar大鼠靜脈注射脂多糖(LPS，E coli O111B4,5 mg/kg)復(fù)制內(nèi)毒素休克模型。Northern印跡雜交分析肝臟TNFmRNA表達(dá)，放射免疫法測定血漿TNF的含量。結(jié)果：LPS攻擊后2 h，大鼠肝臟TNF mRNA表達(dá)顯著高于鹽水對照；(雜交信號經(jīng)掃描儀半定量分析37.76±9.84 vs鹽水對照11.26&#

2、177;7.60,P0.01)；血漿TNF水平明顯升高：(21.52±3.16)g/L vs LPS攻擊前(2.19±0.95)g/L,P0.01。靜脈注射LPS后立即給予噻庚啶(Cyp,5 mg/kg)、山莨菪堿(Ani,10 mg/kg)，均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠肝臟TNF mRNA表達(dá)，降低血漿TNF含量；提高休克大鼠的平均動脈血壓(MABP)及休克小鼠的24 h的存活率。結(jié)論：Cyp和Ani均顯著抑制內(nèi)毒素休克TNF基因表達(dá)，具有較強的抗休克作用。主題詞休克，膿毒性；腫瘤壞死因子；基因表達(dá)；脂多糖類；噻庚啶 Effects of cyproheptadine a

3、nd anisodamine on TNFgene expression in endotoxic shockWANG Li-Zan,ZHU Fan-He,WANG Bao-Sheng,CUI Yun-HeDepartment of Pathophysiology,Jining Medical College,Jining (272113)Abstract AIM:To study the effects of cyproheptadine (Cyp) and anisodamine (Ani) on TNF gene expression in endotoxic shock.METHODS

4、：Endotoxic shock in rats was produced by iv injection of LPS (E coli O111B4,5 mg/kg).TNF mRNA levels in rat liver was assessed by Northern blot.Plasma TNF contents were determined by radioimmunoassay.RESULTS：The TNF mRNA levels in rat liver at 2 h after LPS challenge was increased obviously (autorad

5、iograms were analyzed by scanning: 37.76±9.84 vs saline control 11.26±7.60,P0.01); The plasma TNF mRNA levels in liver and plasma TNF contents at 2 h after iv LPS,and elevated the mean arterial blood pressure (MABP) of the shocked rars.Cyp and Ani markedly improved the mouse survival rate

6、24 h after LPS(20 mg/kg) challenge.CONCLUSION：TNF gene expression increased obviously in endotoxic shock.Cyp and Ani strongly inhibited LPS-induced TNF gene expression,and have a beneficial antishock effects.MeSHShock,septic; Tumor necrosis factor; Gene expression; Lipopolysaccharides; Cyproheptadin

7、e腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)是內(nèi)毒素激活單核/巨噬細(xì)胞所釋放的一種多肽類細(xì)胞因子。許多動物實驗和臨床研究表明TNF是介導(dǎo)敗血癥休克和組織損傷的重要介質(zhì)13。因此，抑制TNF的產(chǎn)生和對抗TNF的作用是防治敗血癥休克和組織損傷的重要措施。已有實驗表明抗TNF單克隆抗體能較好的防治敗血癥休克4，5。噻庚啶(cyproheptadine,Cyp)為一哌啶類抗5-羥色胺和抗組胺藥，我們以往的研究證明噻庚啶具有較強的抗失血性休克作用6。山莨菪堿(anisodamine,Ani)是臨床上常用的抗休克藥，以往的研究表明其抗休克機制主要與擴張微血管、改善微循環(huán)以及細(xì)胞保護(hù)

8、作用有關(guān)。本研究旨在觀察噻庚啶和山莨堿對內(nèi)毒素休克TNF基因表達(dá)的影響，探討抗休克作用及機制。材料與方法(一)材料：LPS(E coli O111B4，中國藥品生物制品檢定所)；總mRNA提取試劑盒和隨機引物DNA探針標(biāo)記試劑盒(Promega公司)；-32P dCTP(北京福瑞生物工程公司)；小鼠TNFcDNA PUC-19(北京腫瘤研究所提供)；TNF放免試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所)；Cyp(濟南永寧制藥有限公司)；Ani(泰興制藥廠)；地塞米松(dexamethasone,Dex,青島第三制藥廠)；前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2,Sigma公司)；Wista

9、r大鼠由山東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。(二)內(nèi)毒素休克模型復(fù)制：雄型Wistar大鼠，體重200250 g，20%烏拉坦(1 g/kg,ip)麻醉，手術(shù)分離左側(cè)頸總動脈并插管(管內(nèi)充滿1肝素生理鹽水)，壓力信號經(jīng)壓力換能器輸入RM-6 200型四導(dǎo)生理記錄儀(日本光電)，記錄平均動脈血壓(MABP)；分離右側(cè)頸外靜脈并插管，以供給藥和輸液用。動物穩(wěn)定10 min后，記錄正常血壓值。自右頸外靜脈注射LPS 5 mg/kg。(三)實驗分組：動物隨機分為6組：(1)鹽水對照組：生理鹽水5 ml/kg,iv。下述各組于靜脈注射LPS 5 mg/kg后，立即靜脈注射。(2)LPS+鹽水組：用等量生理鹽水

10、代藥物。(3)LPS+Dex組：Dex 5 mg/kg。(4)LPS+Cyp組：Cyp 5 mg/kg。(5)LPS+Ani組：Ani 10 mg/kg。(6)LPS+PGE2組：PGE2 2 mg/kg。觀察給予LPS 4 h MABP的變化。另8只動物于注射LPS(1組為鹽水)后2 h處死，取肝臟組織測定TNF mRNA水平。(四)組織總RNA提取和Northern雜交分析：組織總RNA提取按照Chomczynski和Sacchi所描述的方法進(jìn)行7。取總RNA 30 g,1%甲醛凝膠電泳，將變性RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，真空干燥。將含鼠的TNF cDNA PUC-19轉(zhuǎn)入大腸桿菌擴增，經(jīng)

11、純化、酶切、低熔點膠回收鼠的TNF cDNA基因片段。隨機引物法標(biāo)記-32P dCTP制備小鼠TNF cDNA探針。經(jīng)預(yù)雜交后，與小鼠TNF cDNA探針雜交24 h，雜交后先用1×SSC和0.1% SDS洗膜2次，再用0.2×SSC和0.1% SDS洗膜3次。置-70放射性自顯影，用激光密度計(Sweden Pharmacca LKB XL ultrscan)分析雜交信號。(五)TNF檢測：各組于注射LPS前和注射LPS(對照組為生理鹽水)后2 h，頸總動脈抽取血液樣品，10% EDTA Na2抗凝，即刻分離血漿，-20保存待測。TNF含量檢測按說明書進(jìn)行，樣品均作平行管

12、，應(yīng)用FF-646A型微機放免儀測定放射性。微機按預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。(六)存活實驗：雌性小鼠，體重2025 g，腹腔注射內(nèi)毒素20 mg/kg，隨機分組并立即靜脈注射：(1)鹽水對照組：生理鹽水5 mL/kg iv。(2)LPS+鹽水組：用等量生理鹽水代替藥物。(3)LPS+Dex組：Dex 5 mg/kg iv。(4)LPS+Cyp組：Cyp 5 mg/kg iv。(5)LPS+Ani組：Ani 10 mg/kg iv。(6)LPS+PGE2組：PGE2 2 mg/kg iv。評價內(nèi)毒素攻擊后24 h各組動物的存活情況。(七)統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)均以

13、7;s表示，方差分析q檢驗。存活率采用2檢驗。結(jié)果(一)TNF的基因表達(dá)：LPS攻擊后2 h，肝組織TNF mRNA表達(dá)顯著高于鹽水對照(雜交信號經(jīng)掃描儀半定量分析37.76±9.84 vs鹽水對照11.26±7.60,P0.01)。LPS攻擊后，立即靜脈給予Dex 5 mg/kg、Cyp 5 mg/kg、Ani 10 mg/kg或PGE2 2 mg/kg均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF mRNA表達(dá)。給藥后2 h，肝臟TNF mRNA表達(dá)分別比LPS+鹽水對照組降低62%、52%、47%、53%。見1。Fig 1 Effects of Dex,Cyp,Ani and PGE

14、2 on LPS-induced TNF mRNAexpression.Autoradiograms of Northern blot were scanned with a laser densitometerto quantitate the relative TNF mRNA levels.Total RNA from the ratliver was extracted at 2 h after iv LPS.±s; n=8;*P0.01,vs saline control; +P0.01,vs LPS+saline group1地塞米松、噻庚啶、山莨菪堿和前列腺素E2對LP

15、S誘導(dǎo)的TNF mRNA表達(dá)的影響(二)血漿TNF水平：LPS攻擊前，各組動物血漿TNF含量無顯著性差異。LPS攻擊后2 h，血漿TNF水平顯著升高(vs LPS攻擊前，P0.01)。與鹽水對照組有高度顯著差異。靜脈注射LPS后立即靜脈給予Dex 5 mg/kg、Cyp 5 mg/kg,Ani 10 mg/kg、PGE2 2 mg/kg,血漿TNF水平顯著低于LPS+鹽水對照組。見表1。 表1地塞米松、噻庚啶、山莨菪堿和前列腺素E2對大鼠血漿TNF含量的影響Tab 1 Effect of dexamethasone,cyproheptadine,anisodamine and prostagl

16、andin E2 onplasma TNF contents in rats (±s,n=11)GroupBefore endotoxin challenge(g/L)2 h after endotoxinchallenge(g/L)Saline control2.06±0.832.18±1.07LPS+saline2.19±0.9521.52±3.16*LPS+Dex2.21±0.674.72±1.87*LPS+Cyp1.98±0.867.83±2.39*LPS+Ani2.36±0.928.0

17、5±2.96*LPS+PGE22.07±0.515.72±2.14*P0.01，vs saline control;*P0.01,vs before endotoxin challenge;*P0.01,vs LPS+saline group (三) 平均動脈血壓(mean arterial blood pressure,MABP)的變化：內(nèi)毒素攻擊前各組MABP無顯著差異(P0.05)；內(nèi)毒素攻擊后各組動物的MABP急劇下降，30、60 min時MABP與注射內(nèi)毒素前相比較均有顯著差異，動物處于休克狀態(tài)。在LPS+鹽水組于注射內(nèi)毒素后MABP持續(xù)下降，120、2

18、40 min時MABP降至基礎(chǔ)血壓的50%左右，動物處于嚴(yán)重的休克狀態(tài)。在其它各組注射內(nèi)毒素后90 min即見MABP回升，120、240 min時MABP與生理鹽水對照組相比較均有高度顯著差異(P0.01)。見2。Fig 2 Time course of mean arterial blood pressure before and after endotoxin challenge and different kinds of treatment.±s,n=11; ?P0.05,?P0.01,vs control group2內(nèi)毒素攻擊前后及不同處理后平均動脈血壓的變化(四) 存

19、活實驗：Dex、Cyp、Ani和PGE2對致死劑量的LPS(20 mg/kg)攻擊的小鼠能顯著提高24 h存活率。見表2。表2地塞米松、噻庚啶、山莨菪堿和前列腺素E2對內(nèi)毒素攻擊的小鼠24 h存活率的比較Tab 2 Effect of dexamethasone,cyproheptadine,anisodamine and prostaglandin E2 on 24 h suivival rate in endotoxin challeneged mice (±s)GroupAliveDeadTotalSurvival rateSaline control20-20100%LPS+

20、saline3172015%LPS+Dex1912095%?LPS+Cyp1642080%?LPS+Ani1552075%?LPS+PGE21372065%?*P0.01,vs LPS+saline group 討論本研究表明，LPS攻擊后大鼠肝臟TNF mRNA水平和血漿TNF含量顯著升高，MABP明顯降低，動物處于嚴(yán)重的休克狀態(tài)，Cyp和Ani均能顯著性降低TNF mRNA水平和血漿TNF含量，提高休克大鼠的MABP,并提高致死劑量內(nèi)毒素攻擊的小鼠的24 h存活率。提示內(nèi)毒素休克時TNF的基因表達(dá)顯著增加；Dex和Ani通過抑制LPS誘導(dǎo)的TNF的基因表達(dá)，具有較強的抗休克作用。Cyp為5

21、-HT及組胺H1受體的拮抗劑，具有抗炎鎮(zhèn)痛、Ca2+內(nèi)流阻滯及自由基清除作用，對自氧化及自由基發(fā)生系統(tǒng)誘導(dǎo)離體大鼠心、肝、腦組織及心肌線粒體膜的脂質(zhì)過氧化均有抑制效應(yīng)。Cyp對內(nèi)毒素休克犬預(yù)防肺內(nèi)血小板的聚集，防止成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)的發(fā)生8。 我們以前的研究證明Cyp具有較強的抗休克作用。本研究表明Cyp對LPS誘導(dǎo)的TNF基因表達(dá)具有顯著的抑制作用，這可能是其抗內(nèi)毒素休克的重要機制。Cyp抑制TNF基因表達(dá)的機制尚不清楚。Ani是臨床上常用的抗休克藥物。以往的研究證明Ani的抗休克機制與其擴張微血管和改善微循環(huán)以及對細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)。本研究表明Ani對內(nèi)毒素休克TNF的基因表達(dá)

22、亦具有顯著的抑制作用。提示Ani抗內(nèi)毒素休克機制還與抑制TNF的產(chǎn)生有關(guān)。Ani抑制TNF基因表達(dá)的機制尚不清楚。有資料表明9Ani可具有腎上腺皮質(zhì)激素樣的作用，提高血小板內(nèi)的cAMP濃度。推測Ani可能通過升高細(xì)胞的cAMP途徑而抑制TNF基因表達(dá)。Gong等10證明TNF的表達(dá)受cGMP上調(diào)和cAMP下調(diào)。*山東省科委資助課題作者單位：濟寧醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室(濟寧272113)王立贊朱凡河王保生崔運河組織胚胎教研室參考文獻(xiàn)1Tracey KJ.The acute and chronic pathophysiologic effects of TNF: mediation of sept

23、ic shock and wasting(cachexia).In: Beutler B.The molecules and their emerging role in medicine.New York: Raven Press Ltd,1992.22573.2Tracey KJ,Beutler B,Lowry SF,et al.Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin.Science,1986,234:470.3Damas P,Reuter A,Gysen P,et al.Tumor necrosis factor and interleukin-1 serum levels during severe sepsis in humans.Crit Care Med,1989,17:975.4Tracey KJ,Fong Y,Hesse DG,et al.Anti-cachectin/TNF monocloal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia.Nature,1987,330:662.5Hinshaw LB,Tekamp-Olson P,C