第一章血液樣本采集和血涂片制備

1、第1章 血液樣本采集和血涂片制備1、 血液生理概要1、 血液組成：由血細胞(紅細胞、白細胞、血小板)和血漿組成 血漿：血液加抗凝劑后分離出來的淡黃色液體 血清：離體后的血液自然凝固析出的淡黃色透明液體 兩者區(qū)別:血清缺少某些凝血因子，如凝血因子(纖維蛋白原)、(凝血酶原)、等；血漿除鈣離子外，含有其他全部凝血因子。 全血適用于臨床血液學檢查，如血細胞計數(shù)、分類和形態(tài)學檢查等。 血漿適用于血漿生理性和病理性化學成分的測定，特別是內分泌激素測定，也適用于血栓與止血的檢查。 血清適用于臨床化學和臨床免疫學檢查。2、 血液理化性質： 血量：正常成人4-5L，約為70±10mlkg體重，占體重

2、的6%-8%，其中血漿占55%，血細胞占45%。 顏色：動脈血氧和血紅蛋白含量較高，呈鮮紅色； 靜脈血還原血紅蛋白含量較高，呈暗紅色。 嚴重貧血者顏色變淺，嚴重一氧化碳或氰化物中毒者，呈櫻桃紅色。 pH：正常人7.35-7.45。動脈血為7.40，靜脈血為7.35 血液比密：男性為1.055-1.063，女性為1.051-1.060。血漿為1.025-1.030，血細胞為1.090。血液比密與紅細胞含量、血紅蛋白含量有關，血漿比密和血漿內蛋白濃度有關。 血漿滲透壓：290-310mOsm(kg·H2O)。3、 血液特性：紅細胞的懸浮穩(wěn)定性、黏滯性、凝固性4、 生理功能：運輸功能、協(xié)調

3、功能、維護機體內環(huán)境穩(wěn)定和防 御功能2、 采血方法1、 靜脈采血法2、 皮膚采血法(曾稱毛細血管采血法)3、 真空采血法(又稱負壓采血法)：采血裝置分：套筒式、頭皮靜脈式3、 抗凝劑選擇抗凝：用物理或化學的方法除去或抑制血液中的某些凝血因子，以阻止血液凝固?？鼓齽┗蚩鼓镔|：能夠阻止血液凝固的物質。常用抗凝劑和使用方法如下：1、 乙二胺四乙酸(EDTA)鹽：常用有鈉鹽)(EDTA-Na2·H2O)或鉀鹽(EDTA-K2·H2O)，能與血液中鈣離子結合成鰲合物，使Ca2+失去凝血作用，阻止血液凝固。EDTA鹽對血細胞形態(tài)、血小板計數(shù)影響很小，適用于血液學檢查，尤其是血小板計數(shù)

4、。但鈉鹽溶解度低于鉀鹽，有時影響抗凝效果。國際血液學標準委員會(ICSH)建議CBC(全血細胞計數(shù))抗凝劑用EDTA-K2·2H2O，量為1.5-2.2Mg/ml血液。不適于凝血檢查、血小板功能試驗。2、 草酸鹽：常用有草酸鈣、草酸鉀、草酸銨，溶解后解離的草酸根離子能與血液中鈣離子形成草酸鈣沉淀，是Ca2+失去凝血作用，阻止血液凝固。優(yōu)點是溶解度好、價廉。對凝血因子的保護作用差，影響凝血酶原時間測定，而且草酸鹽與鈣結合后形成的沉淀物，影響自動凝血儀檢測結果，因此，不適于凝血檢查。雙草酸鹽抗凝劑：草酸鉀可使紅細胞體積縮小，草酸銨則可使紅細胞脹大，二者按適當比例混合，恰好不影響紅細胞形態(tài)

5、和體積，可用于血細胞比容(Hct)、CBC、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)(Ret)等項目檢查?？墒寡“寰奂?、影響白細胞形態(tài)，不適于血小板計數(shù)、白細胞分類計數(shù)。3、 肝素：加強抗凝血酶(AT-)滅活絲氨酸蛋白酶作用，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等作用，從而阻止血液凝固，是生理性抗凝劑。廣泛存在于肺、肝、脾等幾乎所有組織和血管周圍肥大細胞和嗜堿性粒細胞顆粒中，帶有較多負電荷。常用肝素鈉鹽或鉀鹽，每毫升血液肝素用量為15±2.5U。優(yōu)點是抗凝力強、不影響血細胞體積、不易溶血等。絕大多數(shù)檢查都可用肝素作為抗凝劑，是紅細胞滲透脆性試驗的理想抗凝劑。但可引起白細胞聚集，瑞氏染色后產(chǎn)生藍色背景，不適于C

6、BC、細胞形態(tài)學檢查。4、 枸櫞酸鹽：常用有枸櫞酸鈉，能與血液中鈣離子結合形成螯合物，阻止血液凝固。但溶解度低，抗凝力不如上述抗凝劑。適用于紅細胞沉降率、凝血檢查，也是輸血保養(yǎng)液的成分。與血液的抗凝比例為1：9(凝血功能的檢查)或1：4(血沉)。4、 血液涂片制備1、 載玻片的清潔：新載玻片常帶有游離堿質，必須用1mol/HCL浸泡24h，清水沖洗，干燥后備用。用過的載玻片可用適量肥皂或其他洗滌劑煮沸20min，趁熱刷去血膜，清水沖洗，必要時蒸餾水浸泡，干燥后備用。要保持載玻片的清潔、干燥、中性、無油膩。2、 血涂片的制備：有手工推片法、載玻片壓拉法、棕黃層圖片法等。血涂片可用非抗凝靜脈血或毛

7、細血管血，也可用EDTA抗凝血液制備。EDTA抗凝血有時能引起紅細胞皺縮和白細胞聚集，因此最好使用非抗凝血制備血涂片。 一張良好的血涂片，應厚薄適宜、頭體尾分明、細胞分布均勻、血膜邊緣整齊，并留有一定空隙。5、 血液細胞染色 血涂片在用光學顯微鏡觀察前需要固定和染色。 固定：將細胞蛋白質和多糖等成分迅速交聯(lián)凝固，以保持細胞原有形態(tài)結構不發(fā)生變化。 染色：是使細胞的主要結構，如細胞膜、細胞質、細胞核等染上不同的顏色，以便于鏡下觀察識別。染色方法大多源自羅氏染色法，常用瑞氏染色法、姬姆薩染色法。1、 瑞氏染色法：瑞氏染料 由酸性染料伊紅(E-)和堿性染料亞甲藍(M+)組成。伊紅通常為鈉鹽，有色部分

8、為陰離子。亞甲藍(又名美藍)為四甲基硫堇染料，通常為氯鹽，即氯化美藍，有色部分為陽離子。美藍容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料(即天青)。將適量伊紅、美藍溶解在甲醇中，即為瑞氏染料。甲醇作用：一是溶解美藍和伊紅；二是固定細胞形態(tài)。染色原理 既有物理的吸附作用，又有化學的親和作用。pH值的影響 細胞各種成分均屬蛋白質，由于蛋白質系兩性電解質，所帶電荷隨溶液pH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結合，紅細胞和嗜酸性粒細胞染色偏紅，細胞核呈淡藍色或不染色；在偏堿性環(huán)境中負電荷增多，易與美藍結合，所有細胞呈灰藍色，顆粒呈深暗，嗜酸性顆粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性顆粒偏粗，呈紫黑色。稀釋染液必須

9、用緩沖液，沖洗用水應近中性，否則可導致細胞染色反應呈色異常，形態(tài)難以識別，甚至錯誤。染色方法采血推片干燥標記染色：滴加液3-5滴，使其迅速蓋滿血涂片，約0.5-1min后，滴加等量或稍多的液，輕輕搖動或用吸而球吹氣，使染液充分混合沖洗：5-10min后用流水沖去染液，待干后鏡檢注意事項血涂片面積太小會影響結果觀察，故應在距載玻片另一端2cm處結束推片為宜應于血涂片干透后固定，否則細胞在染色過程中容易脫落加染液應適量，過少易蒸發(fā)形成沉淀，使細胞不易檢查沖洗時應以流水沖洗，不能先倒掉染液，以防染料沉著在血涂片上。沖洗時間不能過久，以防脫色。如血涂片上有染料顆粒沉積，可滴加甲醇，然后立即用流水沖洗染

10、色過淡可以復染，復染時應先加緩沖液，后加染液。染色過深可用流水沖洗或浸泡，也可用甲醇脫色。2、 姬姆薩染色：染色原理 姬姆薩染液由天青、伊紅組成。原理和結果和瑞氏染色基本相同染色方法同瑞氏染色-步驟固定：將干燥后的血涂片用甲醇固定3-5min染色：將血涂片置于用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.4-6.8)稀釋10-20倍的姬姆薩染液中，浸泡10-30min沖洗6、 方法學評價1、 血涂片制備：手工推片法用血量少、操作簡單，是應用最廣泛的方法。棕黃層涂片法可提高異常情況的陽性檢出率。此外，瘧原蟲、微絲蚴等檢查可采用厚血涂片法。2、 血液細胞染色：瑞氏染色法是最經(jīng)典、最常用的染色法，尤其對于細胞質成分、中性顆粒等可獲得很好的染色效果，但對細胞核的著色略差。姬姆薩染法對細胞核、寄生蟲(如瘧原蟲等)著色較好，結構更清晰，但對細胞質成分的著色能力較差。7、 質量控制1、 血涂片制備：血滴愈大、角度愈大、推片速度愈快，血膜愈厚，反之則