腦缺血再灌注后腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因表達(dá)與調(diào)節(jié)

1、    腦缺血再灌注后腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子的基因表達(dá)與調(diào)節(jié)        摘要：目的：探討腦缺血再灌注損傷后腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)mRNA水平的變化規(guī)律,推測(cè)BDNF對(duì)損傷病理的影響。方法：線栓法制作大鼠腦缺血再灌注模型,原位雜交檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)BDNFmRNA,象分析間接定量BDNFmRNA水平。結(jié)果：(1)腦缺血及缺血再灌注均能誘導(dǎo)雙側(cè)海馬神經(jīng)元BDNFmRNA水平增高;(2)缺血損傷過重后海馬神經(jīng)元BDNFmRNA水平增高的程度反而小;(3

2、)再灌注后BDNFmRNA的水平繼續(xù)升高,高峰值出現(xiàn)在12小時(shí),至72小時(shí)降至對(duì)照組水平;兩側(cè)海馬的變化趨勢(shì)類似。結(jié)論：海馬神經(jīng)元在腦缺血及再灌注損傷后將升高BDNFmRNA的表達(dá)以保護(hù)神經(jīng)元,海馬各區(qū)BDNFmRNA基礎(chǔ)水平與海馬神經(jīng)元病理改變程度呈負(fù)相關(guān)。關(guān)鍵詞：腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子腦缺血再灌注海馬原位核酸分子雜交The brain-derived neurotrophic factor mRNA level changes following trainsient focal brain ischemia and reperfusion in brainShi XiangqunLu Bin

3、gxunMI Runfaet al.（Department of Neurology,Lanzhou Military General Hospital,Lanzhou 730050）Abstract：Objective： To study the change of brain-derived neurotrophic factor mRNA (BDNFmRNA)in hippocampus and the effect of BDNF on the hippocampus neurons after focal cerebral ischemia and reperfusion in ra

4、ts.Methods:The level of BDNFmRNA was measured in the rat hippocampus using in situ hybridization.Results :(1)The level of BDNFmRNA in the bilateral hippocampus was increased after cerebral ischemia and reperfusion.(2)The lower level of BDNFmRNA in the hippocampus with serious ischemia was found than

5、 that with slight ischemia.(3)The level of BDNFmRNA following the reperfusion was increased continuously.It was the highest at 12 hours and recovered basal level at 72 hours after the reperfusion.Conclusion： The regional basal BDNFmRNA level showed here positively correlated with cellular resistance

6、 to ischemic damage,and it was consistent with the hypothesis of a neuroprotective role of BDNF.Key words：Brain-derived neurotrophic factorCerebral ischemia ischemia reperfusionHippocampussitu hybridization腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neuro-trophic factor,BDNF)廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng),以海馬的水平最高,它調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化成熟和再生1。雖然

7、成年后腦組織中BDNF水平較低,但是在諸多因素影響下,如腦外傷2、癲癇發(fā)作3、腦缺血4，5,其表達(dá)水平均發(fā)生很大的變化。本實(shí)驗(yàn)的目的在于觀察腦缺血再灌注損傷對(duì)海馬BDNFmRNA水平的影響,及探討其與病理改變的關(guān)聯(lián)性。1材料和方法1.1動(dòng)物分組和模型制作:選用成年雄性Wistar大鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。體重300±20g。常規(guī)飼料飼養(yǎng)。術(shù)前禁食一晚,但不禁水。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照、缺血1小時(shí)、缺血3小時(shí)再灌注0、1、3、6、12、24、72小時(shí),共9組,每組動(dòng)物4只,共36只。大鼠腦缺血再灌注模型參照Masumura M6等人的方法，應(yīng)用線栓法制作。動(dòng)物麻醉清醒后即可見到

8、動(dòng)物有不同程度的神經(jīng)功能缺損，如伸抓不全、動(dòng)物行走時(shí)轉(zhuǎn)圈、嚴(yán)重時(shí)傾倒。未見意識(shí)不清。無神經(jīng)功能缺損的不計(jì)入本組實(shí)驗(yàn)。1.2標(biāo)本收集和處理：動(dòng)物按常規(guī)行灌注固定、去顱骨取腦，并浸入相同固定液(DEPC水配制)后固定24小時(shí)(4保存),防冰晶處理后,冠狀位切取海馬(厚約2mm),OCT包埋后用恒冷箱切片機(jī)做海馬冠狀位連續(xù)切片,片厚14um,切片貼于經(jīng)滅活RNA酶、硅化和防脫片處理后的清潔載玻片,切片涼干后-20保存待用于原位雜交(一周內(nèi)檢測(cè))同時(shí)行Nissl染色和HE染色。1.3BDNF探針及原位雜交:(1)探針來源: 本室構(gòu)建、擴(kuò)增。(2)探針標(biāo)記: 使用Dig標(biāo)記試劑盒(購(gòu)自Bochringe

9、r Mannheim)經(jīng)PCR標(biāo)記BDNFcDNA單鏈探針。(3)原位雜交: 按常規(guī)進(jìn)行雜交前準(zhǔn)備、預(yù)雜交、雜交、雜交后洗滌和酶免疫檢測(cè)。1.4象分析和統(tǒng)計(jì)分析：用北京航空航天大學(xué)與空軍總醫(yī)院聯(lián)合研制的象分析統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行象分析。分析細(xì)胞平均積分吸光度，間接反應(yīng)細(xì)胞BDNFmRNA水平。使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2.1 光鏡所見: 病理改變主要出現(xiàn)在CA1區(qū)的神經(jīng)元,CA3區(qū)和齒狀回病理改變輕;缺血1小時(shí)即見到CA1區(qū)少數(shù)神經(jīng)元腫脹;缺血3小時(shí)見到腫脹細(xì)胞增多,部分出現(xiàn)缺血變性的表現(xiàn);再灌注24小時(shí)缺血變明顯，部分出現(xiàn)壞死和細(xì)胞脫失至72小時(shí)細(xì)胞脫失更加顯著。其余各區(qū)亦有上述改變

10、，但均比較輕。2.2原位雜交染色：見到海馬各區(qū)神經(jīng)元均為陽性細(xì)胞，染色位于胞漿，胞核無著色。BDNFmRNA以齒狀回水平最高,依次為CA3區(qū)、CA1區(qū);缺血損傷、再灌注損傷后海馬各區(qū)BDNFmRNA水平均升高,仍以齒狀回水平最高,升高幅度各區(qū)相近,無明顯差異;有關(guān)BDNFmRNA的水平變化詳見象分析。各組海馬各區(qū)細(xì)胞平均積分吸光度見表1，2。表1不同缺血時(shí)間海馬各區(qū)BDNF mRNA的水平(±s積分,吸光度/細(xì)胞)  Cont IC1 IC3 LCA3 45.7±6 190.1±25* 61.8±16 LCA1 35.8±6 105.

11、7±24*  41.9±11 LDG  63.6±6 214.1±39* 90.0±11* RCA3  47.2±6  84.3±18* 83.5±16* RCA1 31.6±4  46.2±10  35.5±7 RDG  62.0±8  101.9±21*  69.4±13 注:與對(duì)照組比*P<0.05 IC示缺血，LCA3,LCA1,LDG 分別示左側(cè)海馬C

12、A3,CA1區(qū),和齒狀回，RCA3,RCA1,RDG分別示右側(cè)海馬CA3,CA1區(qū)和齒狀回。表2不同再灌注時(shí)間海馬各區(qū)BDNFmRNA的水平(±s積分，吸光度/細(xì)胞)  Cont I3R1 I3R3 I3R6 I3R12 I3R24 I3R72 LCA3  45.7±6 123.2±21* 357.3±41* 523.4±42*  679.6±22* 89.5±14* 55.4±5 LCA1 35.8±6  59.0±15 151.9±33* 2

13、52.5±36* 384.3±26* 71.7±13* 40.2±6 LDG  63.6±6  157.5±23*  371.5±36* 538.4±43* 701.9±24*  112.9±43* 60.7±7 RCA3 47.2±6  91.5±12* 178.4±29*  358.6±31* 467.6±58*  58.7±13 41.8±7

14、 RCA1  31.6±4  63.4±18* 84.8±11* 145.3±20*  181.7±33*  48.1±9  33.6±6 RDG  62.0±8  103.6±23* 187.1±16*  402.1±34* 522.8±42*  73.7±16  57.9±5 注:與對(duì)照組比*P<0.05 IR示缺血再灌注及時(shí)間LCA3,LCA1,

15、LDG 分別示左側(cè)海馬CA3,CA1區(qū),和齒狀回，RCA3,RCA1,RDG分別示右側(cè)海馬CA3,CA1區(qū)和齒狀回。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示：缺血3小時(shí)再灌注不同時(shí)間點(diǎn)海馬各區(qū)BDNFmRNA的水平變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),高峰值出現(xiàn)在12小時(shí),至72小時(shí)降至對(duì)照水平,雙側(cè)海馬有類似的變化趨勢(shì);缺血1小時(shí)的BDNFmRNA的水平較缺血3小時(shí)的高(P<0.01)。正常海馬各區(qū)BDNFmRNA基礎(chǔ)水平相差顯著(P<0.05),齒狀回水平最高,但損傷后各區(qū)增高倍數(shù)相近。結(jié)合光鏡病理改變發(fā)現(xiàn)BDNFmRNA基礎(chǔ)水平低的域病理改變重。3討論BDNF是典型的靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,但亦存在自分

16、泌和旁分泌作用方式,其營(yíng)養(yǎng)譜廣泛,神經(jīng)元表達(dá)BDNF的水平受多種因素的調(diào)節(jié)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過程中的水平較高，隨著機(jī)體發(fā)育成熟其水平逐漸降低7。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BDNFmRNA在缺血損傷過程中海馬各區(qū)的表達(dá)水平升高,損傷神經(jīng)修復(fù)后水平降低,與生長(zhǎng)發(fā)育過程的特點(diǎn)相似。海馬在腦損傷過程中敏感性高，較易受到損傷8。海馬神經(jīng)元BDNFmRNA水平在不同生理、病理狀態(tài)下是不同的,腦外傷、腦缺血、癲癇發(fā)作時(shí)BDNFmRNA水平增高9,而慢性應(yīng)激反應(yīng)時(shí)海馬BDNFmRNA水平降低。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：缺血再灌注損傷均能升高BDNFmRNA水平,再灌注損傷的高峰出現(xiàn)于再灌后12小時(shí);腦缺血3小時(shí)BDNFmRNA的

17、水平較缺血1小時(shí)低,復(fù)習(xí)有關(guān)文獻(xiàn)我們認(rèn)為腦缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元表達(dá)BDNF水平提高的原因可能是海馬的保護(hù)性反應(yīng),有利于損傷神經(jīng)元的恢復(fù)。而關(guān)于腦缺血再灌注BDNFmRNA峰值出現(xiàn)的時(shí)間存在差異4，5，10,其原因與缺血、損傷程度不同有關(guān)。缺血后BDNFmRNA的水平變化在雙側(cè)海馬出現(xiàn),且變化趨勢(shì)相似,其可能的機(jī)制是播散性抑制機(jī)制11(spreading depression like mechanism),產(chǎn)生的基礎(chǔ):谷氨酸等興奮性遞質(zhì),因海馬的這一變化可被NMDA受體拮抗劑阻斷8，12。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示:BDNFmRNA水平高及反應(yīng)高的區(qū)域病理改變輕。提示BDNFmRNA水平增高有利于

18、損傷的細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、恢復(fù),是海馬細(xì)胞對(duì)損傷做出的一種保護(hù)反應(yīng)。Ohara利用腦室內(nèi)注射外源性BDNF,發(fā)現(xiàn)足量的外源性BDNF能夠?qū)ｑR細(xì)胞缺血損傷后的死亡起到保護(hù)作用13,而且外源性BDNF能提高突觸效應(yīng)和海馬的AMP和IP3的水平13,細(xì)胞培養(yǎng)亦顯示BDNF能促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)。作者單位：石向群（730050甘肅蘭州市蘭州軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）陸兵勛（廣州南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科） 米瑞發(fā)（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院三所）范明（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院三所）參考文獻(xiàn)：1Wetmore C,Ernfors P,Persson H,et al.Localization of brain-derived neurotro

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