血管端端吻合法建立雙側(cè)供腎大鼠腎移植模型

1、血管端端吻合法建立雙側(cè)供腎大鼠腎移植模型         【摘要】  目的：采用血管端端吻合法建立一種無需阻斷主動(dòng)脈和后腔靜脈血流的雙側(cè)供腎大鼠腎移植模型。方法：取供體雙側(cè)腎臟，受體左側(cè)腎窩單腎移植，生理鹽水中血管端端吻合，輸尿管膀胱瓣膀胱外隧道式吻合行尿路重建。結(jié)果：40例移植腎腎動(dòng)、靜脈即時(shí)通暢率分別為85%（34/40）、90%（36/40），吻合血管無扭曲。模型并發(fā)癥有吻合口出血、動(dòng)靜脈血栓形成、排斥反應(yīng)等，不使用免疫抑制劑的情況下，90%受體存活時(shí)間超過7 d。結(jié)論：生理鹽水中行血管端端吻合，可

2、解決動(dòng)脈吻合需阻斷主動(dòng)脈血流、靜脈吻合需支架支撐、靜脈粘貼縫合困難等問題，是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)的模型方法，一般實(shí)驗(yàn)室均可開展。 【關(guān)鍵詞】  靜脈 吻合 腎移植 動(dòng)物模型 大鼠   大鼠腎移植模型是研究移植免疫排斥反應(yīng)及各種藥物對(duì)移植腎影響的重要?jiǎng)游锬Ｐ汀ahlavan等1認(rèn)為對(duì)于大鼠腎移植模型，腎動(dòng)脈端端吻合是金標(biāo)準(zhǔn)，最為推薦腎靜脈端端吻合。目前，國(guó)內(nèi)尚無不阻斷腹主動(dòng)脈和后腔靜脈血流的血管端端吻合雙側(cè)供腎大鼠腎移植模型的相關(guān)報(bào)道。我們參閱相關(guān)文獻(xiàn)，成功建立了無需阻斷腹主動(dòng)脈、后腔靜脈血流，無需支架支撐血管壁的一種血管端端吻合雙側(cè)供腎大鼠腎移植模型，為移植排斥

3、反應(yīng)、移植免疫耐受等研究提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)的方法。   1  材料和方法   1.1  材料   1.2  方法   于腹主動(dòng)脈分叉處頭側(cè)包繞主動(dòng)脈和后腔靜脈預(yù)置1根0號(hào)絲線，腎動(dòng)脈前方1 cm預(yù)置2根0號(hào)絲線，分別包繞主動(dòng)脈及后腔靜脈。結(jié)扎、切斷腸系膜上動(dòng)脈，結(jié)扎、切斷腎上腺動(dòng)、靜脈并留標(biāo)記尾線。經(jīng)*背靜脈注入肝素125 U后，分別結(jié)扎預(yù)置線，于腹主動(dòng)脈分叉結(jié)扎線近心端插入靜脈留置針，以4含肝素鈉林格液灌洗雙側(cè)腎臟，灌注壓力保持在80 cm H2O（7.85 kPa)，至雙腎

4、成均一淺土黃色、雙腎靜脈流出液清亮為止，迅速用冰屑覆蓋雙腎。齊主動(dòng)脈壁處剪斷左右腎動(dòng)脈，齊后腔靜脈管壁處剪斷左腎靜脈，平左腎靜脈前緣及后腔靜脈結(jié)扎線前方剪斷后腔靜脈，并將其修剪成右腎靜脈的一部分。右腎靜脈和后腔靜脈的距離非常短，因不能很好的固定血管夾以至于行原位右腎靜脈的端端吻合非常困難；又因大鼠腎靜脈直徑與后腔靜脈直徑相近，故我們將后腔靜脈的一部分修整為腎靜脈的一部分以延長(zhǎng)右腎靜脈，并將右腎放置左腎窩處，以便行右腎移植及腎靜脈的端端吻合術(shù)。供腎置于盛有04肝素生理鹽水的無菌冰盒中。   供腎置于受體左腎窩處、冰屑紗布覆蓋。在10倍顯微鏡下先吻合靜脈再吻合動(dòng)脈。以腎上腺動(dòng)脈

5、斷端標(biāo)記線為縫合第一針的進(jìn)針標(biāo)志，行腎動(dòng)脈兩定點(diǎn)間斷端端吻合，縫合810針；供、受體腎靜脈三定點(diǎn)間斷端端吻合，由于腎靜脈較薄且易粘貼，故在腎窩處噴入生理鹽水以將受、供體腎靜脈浸入生理鹽水，將腎上腺靜脈斷端標(biāo)記線向頭側(cè)放置（右腎將后腔靜脈結(jié)扎線結(jié)擺向頭側(cè)）；輕抖生理鹽水中靜脈管壁數(shù)次，靜脈壁會(huì)自動(dòng)散開，顯露出靜脈斷端和管腔，以標(biāo)記線為吻合標(biāo)志，縫合1216針（圖24）。吻合完畢后，先用血管夾鉗夾腎門血管，撤去腎靜脈血管夾檢查靜脈吻合口，再撤去腎動(dòng)脈血管夾檢查動(dòng)脈吻合口，待檢查滿意后，再開放腎門血管夾（圖5、6），數(shù)秒內(nèi)可見移植腎實(shí)質(zhì)迅速充盈變紅。動(dòng)、靜脈吻合口出血時(shí)可用小棉球持續(xù)輕壓片刻，一般滲

6、血均能停止，必要時(shí)補(bǔ)針。固定移植腎。切開膀胱側(cè)壁23 mm，理順輸尿管，行輸尿管膀胱瓣膀胱外隧道式吻合；受體右腎血管預(yù)置體外結(jié)扎線。            2  結(jié)   果   技術(shù)成熟后，共行40次腎移植實(shí)驗(yàn)。使用水分離法游離輸尿管、腎動(dòng)靜脈，平均耗時(shí)1215 min，較傳統(tǒng)的棉球鈍性分離減少手術(shù)耗時(shí)67 min。取腎耗時(shí)約40 min，移植手術(shù)耗時(shí)5060 min。供腎熱缺血時(shí)間1020 s，左腎冷缺血時(shí)間3540 min，右腎冷缺血時(shí)間65

7、70 min。腎動(dòng)、靜脈吻合完畢后，開放腎動(dòng)、靜脈，腎動(dòng)、靜脈即時(shí)通暢率分別為85%（34/40）、90%（36/40），吻合血管無扭轉(zhuǎn)。血流恢復(fù)后，所有的血流通暢，移植腎均在13 min開始泌尿，術(shù)后3 d自體右腎結(jié)扎后仍有尿液排出，說明移植腎有功能。并發(fā)癥有吻合口出血、休克、靜脈血栓形成、術(shù)后腹腔感染、排斥反應(yīng)等。   3  討   論   大鼠腎移植模型為移植免疫學(xué)研究的重要工具。目前，國(guó)內(nèi)外大多采用單側(cè)供腎進(jìn)行腎移植動(dòng)物模型建立，應(yīng)用雙側(cè)供腎者尚不多見。Yin等于1994年首次采用供腎動(dòng)脈帶主動(dòng)脈瓣、靜脈帶后腔靜脈瓣

8、分別與受體腹主動(dòng)脈、后腔靜脈行端側(cè)吻合，輸尿管帶膀胱瓣與受體作DOM式吻合建立了大鼠雙側(cè)供腎移植模型。此術(shù)式需阻斷主動(dòng)脈和后腔靜脈血流，以至大鼠無血流軀體易形成血栓，開放血流后血栓松動(dòng)脫落導(dǎo)致肺靜脈栓塞、心臟驟停，造成受體在術(shù)中及術(shù)后有較高的死亡率。Grau等于2003年首先報(bào)道不阻斷主動(dòng)脈和后腔靜脈血流的端端血管吻合雙側(cè)供腎大鼠原位腎移植模型。因建立移植腎血循環(huán)的公認(rèn)難點(diǎn)沒有解決，即離斷的游離腎靜脈呈現(xiàn)管壁粘貼、攣縮團(tuán)皺，吻合時(shí)難分清其前后壁，易縫至對(duì)側(cè)壁，易致吻合血管扭曲、瓶頸樣狹窄，耗時(shí)長(zhǎng)，以致很多學(xué)者不愿采用端端吻合腎靜脈或采用支架物支撐靜脈壁的方法進(jìn)行腎靜脈端端吻合。國(guó)內(nèi)學(xué)者馮寧翰等

9、56報(bào)道的大鼠雙側(cè)供腎原位移植，均須阻斷腹主動(dòng)脈血流和使用支架支撐腎靜脈壁后再行動(dòng)靜脈血管端側(cè)吻合術(shù)。   Schumacher等對(duì)近40年的文獻(xiàn)研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，研究者采用復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的腎血管端端吻合法或端側(cè)吻合法來建立移植腎的血液循環(huán)，而不采用CUFF管、支架等方法，其原因是雖然這些方法提高了吻合速度，但是術(shù)后血管狹窄、血栓形成等并發(fā)癥的發(fā)生率均有升高，并不適合腎移植慢性排斥模型的建立。Pahlavan等1在2006年使用Medline檢索到2 300余篇大鼠腎移植相關(guān)文章（19652005），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,血管端端吻合所引起的血管并發(fā)癥最少，腎動(dòng)脈端端吻合是金標(biāo)準(zhǔn),最為推薦

10、腎靜脈端端吻合。至此，解決腎靜脈吻合困難這個(gè)公認(rèn)難點(diǎn)是問題的關(guān)鍵所在。   我們?cè)趯?shí)踐中找了導(dǎo)致離斷腎靜脈吻合困難的原因并解決了問題。血管未游離及切斷時(shí)，腎靜脈內(nèi)的血液對(duì)血管壁側(cè)壓力是維持腎靜脈的充盈狀態(tài)的主要原因。當(dāng)腎靜脈被阻斷并切斷后，維持靜脈充盈的原因消失，外加大氣壓的作用致靜脈管壁塌陷。塌陷的靜脈管壁之間存在液體分子形成固相液相間的附著層黏附力，導(dǎo)致靜脈壁相互粘貼。腎動(dòng)靜脈血管鞘、周圍結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)支撐力是維持腎靜脈管壁保持正常形態(tài)的原因，當(dāng)腎靜脈周圍的血管鞘和結(jié)締組織被剝離后，加之液體表面張力大于菲薄靜脈管壁的彈性阻力，導(dǎo)致菲薄的管壁回縮呈攣縮皺團(tuán)狀，其斷端邊緣不

11、易辨認(rèn)、分開，準(zhǔn)確縫合難度較大，需時(shí)長(zhǎng)（圖1、7）。針對(duì)上述原因，我們將游離的離斷腎靜脈浸入生理鹽水中，使得作用在血管表面的大氣壓力移至鹽水表面，塌陷的靜脈管壁之間充填大量水分子使得附著層黏附力消失，管壁可以在浮力的作用下漂浮（圖2、3）；液體表面張力移至水面，靜脈管壁的組織彈性自然恢復(fù)，攣縮團(tuán)狀自然消失，腎靜脈極易吻合（圖4）。吻合后血管無扭曲狹窄（圖5、6）。   圖7  腎靜脈壁呈塌陷粘貼、團(tuán)縮皺襞（腎靜脈已被縫合1針，×10）   Fig 7  The walls of transected renal vein a

12、nd artery are cohesive,wrinkle,tumbling(renal viens was sutured one stitch，×10）   采用水分離法游離腎、腎血管可清晰顯示后腹膜腔的層次結(jié)構(gòu)，顯露腎動(dòng)脈微小分支、腎靜脈微小屬支，避免了因使用棉球和顯微鑷子鈍性分離帶來的不必要損傷和出血，減少了不必要的手術(shù)操作和時(shí)間。最重要的是使用這種無創(chuàng)分離技術(shù)分離腎、動(dòng)靜脈時(shí)，可避免因鉗夾腎動(dòng)、靜脈管壁而導(dǎo)致的腎動(dòng)脈痙攣，從而避免了移植腎缺血預(yù)適應(yīng)的產(chǎn)生和動(dòng)、靜脈血栓的形成。水分離法游離單側(cè)腎、腎血管平均使用時(shí)間1215 min，手術(shù)時(shí)間較傳統(tǒng)的鈍性游

13、離方法縮短了67 min，且不需要太多的顯微外科手術(shù)技巧。這種無創(chuàng)傷的分離技術(shù)不需要特殊的儀器、器械，簡(jiǎn)單快速安全強(qiáng)效。   大鼠左腎靜脈前緣接受腎上腺后靜脈和膈后靜脈的混合支，右腎靜脈僅接受腎上腺后靜脈。左、右腎動(dòng)脈前緣各發(fā)出1條腎上腺動(dòng)脈下支入腎上腺。無論供體還是受體，水分離法游離腎上腺動(dòng)、靜脈后，結(jié)扎剪斷腎上腺動(dòng)、靜脈并留適當(dāng)長(zhǎng)度尾線，以作為吻合第1針的進(jìn)針標(biāo)記，減少血管吻合時(shí)對(duì)位的盲目性和隨意性，保證了吻合時(shí)血管的正確對(duì)位及吻合血管無扭轉(zhuǎn)。吻合血管時(shí)，標(biāo)記尾線的方向均朝向頭部放置，在兩血管斷端標(biāo)記線的附近相似位置縫合第1針；二定點(diǎn)間斷加針法吻合動(dòng)脈，三定點(diǎn)間斷加針法

14、吻合靜脈，以確保血管吻合時(shí)不發(fā)生扭轉(zhuǎn)，避免動(dòng)、靜脈呈迂曲扭轉(zhuǎn)狀導(dǎo)致人為狹窄，局部血液渦流的形成（圖4）。選用右腎在左腎窩移植，可節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量。   采用水分離法游離腎、腎血管的時(shí)間明顯縮短，手術(shù)使用時(shí)間較傳統(tǒng)的鈍性游離方法縮短；在體修整、原位低溫灌注，使熱缺血時(shí)間15 s,相對(duì)于30 min的熱缺血界限具有明顯優(yōu)勢(shì)；兩次腎移植冷缺血時(shí)間平均分別為40、70 min，整體手術(shù)時(shí)間與供受體11移植兩次手術(shù)相比，總體時(shí)間縮短了。   總之，我們?cè)谏睇}水中行腎靜脈的端端吻合建立的此腎移植模型，為我們腎移植實(shí)驗(yàn)提供了有利條件，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物、科

15、研經(jīng)費(fèi)和手術(shù)時(shí)間，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，穩(wěn)定可靠，成功率較高，一般實(shí)驗(yàn)室均可開展?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1PAHLAVAN P S，SMALLEGANGE C，ADAMS M A，et al.Kidney transplantation in the rats:assessments,complications,and managementJ.Microsurgery，2006，26:404411.MARTINS P N A.Kidney transplantation in the rat:amodified technique using hydrodissectionJ.Microsurgery，2006，26:543546.YIN M，BOOSTER M H，van der BOGAARD A E，et al.A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantationJ.Lab Anim，1994,28:387391.GRAU V，STEINIGER B.Transplantation of both kidneys from one donor ratJ.Lab Anim，2003，37:162165.馮寧翰，錢立新，華立新.一種雙側(cè)供腎大鼠腎移植模型的建立J.中華器官移植