時間分辨熒光免疫分析方法的光譜研究

1、第24卷, 第5期光譜學(xué)與光譜分析2004年5月Spectroscopy and S pectral Analysis Vol 124,No 15,pp5962599May , 2004時間分辨熒光免疫分析方法的光譜研究郭周義, 田振, 賈雅麗華南師范大學(xué)激光生命科學(xué)研究所, 廣東廣州510631摘要時間分辨熒光免疫分析法是用三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物, 標(biāo)記蛋白質(zhì)、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞, 待反應(yīng)體系(如:抗原抗體免疫反應(yīng)、生物素親合反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等 發(fā)生后, 用時間分辨熒光技術(shù)測定反應(yīng)體系中分析物的濃度, 的。它之所以能夠繼放射性同位素

2、標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光、更靈敏的檢測方法, 3+命熒光團(tuán)Eu 螯合物的光譜研究結(jié)果, :336337nm3+的激發(fā)波長, 有利于Eu 主題詞免疫分析; ; Eu 3+螯合物中圖分類號:A文章編號:100020593(2004 0520596204111f f 躍遷光譜引言最近幾年發(fā)展起來的時間分辨熒光免疫分析方法(TR 2FIA 是超微量免疫檢定法的一大突破。由于使用了時間分辨光譜技術(shù)和熒光增強(qiáng)技術(shù), 使熒光免疫分析的靈敏度得到了極大提高。1983年P(guān)etterson 1和Eskola 2首先將時間分辨熒光光譜技術(shù)應(yīng)用于免疫分析的研究中。目前, TRFIA 的最低檢出值已達(dá)10-19mol w

3、ell -1, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過酶標(biāo)記免疫分析法(EIA 的10-9mol well -1, 放射免疫分析法(RIA 的10-15mol well -1和發(fā)光免疫分析法(L IA 的10-15mol L -1。稀土離子是金屬離子, 若用來直接標(biāo)記抗原、抗體, 標(biāo)記率很低, 一般使用含有雙功能基團(tuán)的螯合劑, 形成稀土離子2螯合劑2抗原(或抗體 的螯合物。稀土離子的熒光, 不僅與自身的能級結(jié)構(gòu)有關(guān), 而且與螯合劑的性質(zhì)有關(guān)。螯合物不同, 稀土離子的激發(fā)光和發(fā)射光也會有所不同。指f n 組態(tài)內(nèi), 不同J 能級間躍遷所產(chǎn)生的光譜。它的特點(diǎn)是:(1 發(fā)光弱。這主要是因為f f 躍遷是宇稱選擇規(guī)則禁1稀土離子的吸

4、收光譜鑭系離子的電子排布為21s 2s 22p 63s 23p 63d 104s 24p 64d 104f n 5s 25p 6(n =014 , 其主要價態(tài)有二價、三價和四價。三價態(tài)是特征氧化態(tài), 其n基組態(tài)是4f (n =014 , 下一個激發(fā)態(tài)是4f n -15d 3。稀土離子吸收光譜4的產(chǎn)生可歸因于三種情況。收稿日期:2003203226, 修訂日期:2003206228阻的。雖然在溶液和固態(tài)化合物中, 由于配體場微擾, 也能觀察到相應(yīng)的光譜, 但相對于d d 躍遷來說, 也是相當(dāng)弱的。(2 類線性的光譜。譜帶的尖銳原因是處于內(nèi)層的4f 電子受到5s 2, 5p 6電子的屏蔽, 受環(huán)境

5、的影響較小。(3 譜帶的范圍較廣。在近紫外, 可見區(qū)和近紅外區(qū)內(nèi)的光譜。都能得到稀土離子(112f d 躍遷光譜4f n 向4f n -15d 的躍遷是組態(tài)間的躍遷。這種躍遷是宇稱選擇規(guī)則允許的, 因而4f 5d 的躍遷是較強(qiáng)的; 三價離子的吸收帶一般在紫外區(qū)出現(xiàn); 由于5d 能級易受周圍離子的配體場影響, 相對于f f 躍遷來說, 譜帶變寬。113電荷躍遷光譜稀土離子的電荷躍遷光譜, 是指配體向金屬發(fā)生電荷躍遷而產(chǎn)生的光譜, 是電荷密度從配體的分子軌道向金屬離子軌道進(jìn)行重新分配的結(jié)果。鑭系絡(luò)合物能否出現(xiàn)電荷躍遷帶 取決于配體和金屬離子的氧化還原性。一般在易氧化的配體3+3+和易還原為低價離子

6、(Sm , Eu , Te 3+, Yb 3+和Ce 4+ 的絡(luò)合物光譜中易見到電荷躍遷帶。譜帶的特點(diǎn)是有較強(qiáng)的強(qiáng)度和較寬的寬度?；痦椖?廣東省科技攻關(guān)重點(diǎn)項目(2002C60113 ; 廣州市天河區(qū)科技計劃項目(2002XGP06 ; 廣東省自然科學(xué)基金項目(No 1015012,No. 031518 ; 教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項目(No 102113 資助作者簡介:郭周義, 1965年生, 華南師范大學(xué)激光生命科學(xué)研究所教授, 博士生導(dǎo)師 301, 23415, 292, 189nm 。2稀土離子的熒光性能211稀土的熒光光譜在紫外線等高能射線的激發(fā)下, 處在溶液或化合物中的三價稀土離子

7、被激發(fā), 從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài), 然后再從激發(fā)態(tài)返回到能量較低的能態(tài)時, 放出輻射能而發(fā)光, 這種光即為熒光。稀土離子的熒光光譜也像吸收光譜一樣, 來自三個方面的躍遷:f f 躍遷; 5d 4f 躍遷; 電荷轉(zhuǎn)移躍遷。當(dāng)一些絡(luò)合物的配體不吸收紫外光時, 其熒光的產(chǎn)生, 可通過電荷躍遷或4f n -4f n -15d 躍遷至相應(yīng)的激發(fā)態(tài), 再以非輻射衰變至4f n 組態(tài)的激發(fā)態(tài), 此激發(fā)態(tài)向低能態(tài)躍遷時, 也可產(chǎn)生熒光。212紫外線激發(fā)產(chǎn)生熒光的物理過程4絡(luò)合物熒光的能量躍遷過程, 一般可分三步來說明(躍遷過程見圖1 :(1 先由配體吸收輻射能, 從單重態(tài)的基態(tài)S 0躍遷至激發(fā)態(tài)S 1, 其激發(fā)能

8、可以輻射方式回到基態(tài)S 體熒光 , 或T 2; (2 , 態(tài)(磷光 , 圖中是稀土離子 ; (3 的能量躍遷也有兩種方式, , 再至基態(tài), 或以輻射方式躍遷到較低能態(tài), 此時就產(chǎn)生熒光 。Fig 12Charge 2transfer transition spectrum of Eu 3+halide(1 Eucl 6-3; (EuBr 6-3335D 07F J 的躍遷光譜, 包括電荷轉(zhuǎn)。電荷轉(zhuǎn)移躍遷光譜是配體向稀土離子的電荷轉(zhuǎn)移態(tài)(4f 殼層內(nèi) 發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的, 5D 07F 1, 7F 2, 7F 4的熒光波長分別為590596nm ,610620nm , 687703nm 。而當(dāng)

9、用2二酮體作Eu 3+配位體時, 與電荷轉(zhuǎn)移躍遷不同, 配位體的三重態(tài)與Eu 3+的5D J 態(tài)發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移, 而不是電子密度的重新分配。Eu 3+依靠配位二酮體的能量轉(zhuǎn)移, 可以得到強(qiáng)烈的Eu 3+的5D 07F 2(610620nm 躍遷熒光。我們的實驗表明, 依靠配體的能量轉(zhuǎn)移獲得的Eu 3+的5D 07F 2熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于由于電荷轉(zhuǎn)移或4f 5d 的躍遷吸收所得到的5D 07F 2的熒光強(qiáng)度。4TRFIA 中Eu 3+螯合物的光譜我們在研究TRFIA 方法的過程中, 分別觀察了標(biāo)記化合物中, 以及添加增強(qiáng)液后溶液中形成的Eu 3+螯合物的吸收及熒光譜。這兩種螯合物的吸收帶均在紫外

10、區(qū)。熒光增強(qiáng)Fig 11E nergy level scheme of the energy 2lossprocedure of the excited state從這里得知, 稀土離子長壽命熒光的產(chǎn)生, 是先由配體吸收能量, 然后以非輻射方式, 經(jīng)三重態(tài), 傳遞給稀土離子, 將稀土離子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài), 接著, 處在激發(fā)態(tài)的離子, 以輻射方式躍遷到低能態(tài)而發(fā)出熒光。所以, 要產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光, 選擇合適的配體非常重要。一般來說, 當(dāng)稀土離子的激發(fā)態(tài)與配體的三重態(tài)相當(dāng), 或在其以下時, 就可能由配體的三重態(tài)將能量轉(zhuǎn)移給稀土離子, 產(chǎn)生長壽命熒光。經(jīng)分析可知, 易氧化的配體與易還原的稀土離子組成

11、的絡(luò)合物, 易發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移躍遷。Eu 3+最易還原成Eu 2+。因3+此, 在Eu 的一些絡(luò)合物的吸收譜中, 可經(jīng)常出現(xiàn)電荷轉(zhuǎn)移躍遷5(參見圖2 。電荷躍遷帶的出現(xiàn)與位置, 和配體性質(zhì)3+-有關(guān)。Eu 的Cl , Br -, I -的絡(luò)合物的電荷躍遷帶分別位于Fig 13Absorption spectra of the fluorescent Eu 3+chelate(L 1C , Labelling chelate ; E 1L , Enhancement liquid Eu 3+螯合物的吸收在300350nm 區(qū)間表現(xiàn)出特殊的趨勢(參見圖3 。至少說明, 4f 組態(tài)被激發(fā)的機(jī)制是復(fù)雜的。

12、(我們認(rèn)為可能是依靠微弱的電荷轉(zhuǎn)移或4f 5d 的吸收 , 而且標(biāo)記化合物中Eu 3+的氧和氮的配位體不能起到轉(zhuǎn)移激發(fā)能的作用 。我們注意到這一點(diǎn), 是因為我們在實驗中發(fā)現(xiàn), 這段波長的激發(fā)與5D 07F 2的特征熒光峰的出現(xiàn)及強(qiáng)度有著直接關(guān)系, 說明此時的吸收及能量轉(zhuǎn)移機(jī)制對Eu 3+的5D 0激發(fā)最為有利, 300350nm 是激發(fā)配位二酮體的最佳波段, 參見圖4 。Fig 16Fluorescence spectra of the labeling chelateFig 14Fluorescence of the fluorescent Eu 3+chelate5TRFIA 的時間分辨技

13、術(shù)及熒光增強(qiáng)技術(shù)的原理稀土螯合物經(jīng)紫外激發(fā)后產(chǎn)生的熒光, 不但強(qiáng)度高, 而且熒光衰變時間也長, 大約101000s , 一般生物類樣品的自然本底熒光的衰變時間只有幾微秒, 熒光壽命的大的差異, 為采用時間分辨光譜技術(shù)提供了必要的條件。TRFIA 是時間分辨光譜技術(shù)與熒光增強(qiáng)技術(shù)和免疫分析技術(shù)的結(jié)合。分析的開始, 首先用Eu 3+螯合劑標(biāo)記抗體(或抗原 , 要求螯合劑要有雙功能基團(tuán), 一端螯合Eu 3+, 另一端螯合蛋白質(zhì)。常用的螯合劑有:氨基苯基2EDTA , 異硫氰酸鹽2EDTA , 12(P 2苯雙氮 2EDTA , 它們保證了免疫分析的穩(wěn)定性, 但是不能滿足熒光檢測的需要。選擇既有強(qiáng)烈的

14、螯合能力, 又有好的吸收及能量轉(zhuǎn)移特性的螯合劑是十分困難的, 因此在TRFIA 方法中標(biāo)記抗體和抗原與測量過程是分開進(jìn)行的。為了滿足檢測需要, 在檢測之前, 須向標(biāo)記物中添加一種低p H 值的增強(qiáng)液, 其中包含2二酮體及32辛烷基磷化氫的氧化物等。溶液中會形成含二酮體配位體的Eu 3+螯合物。當(dāng)選擇合適的激發(fā)波長(336337nm 時, 二酮體能夠被有效激發(fā), 使Eu 3+發(fā)出5D 07F J (610620nm 的窄而強(qiáng)的特征熒光峰。1987年, Lehn 6發(fā)明了Eu 離子的一種穴狀化合物, 由于這種穴狀化合物很好地防止了水、氧及其他物質(zhì)對銪離子熒光的猝滅效應(yīng), 且具有良好的親合性, Le

15、hn 和G erard Mathis 將它與X L665(一種穩(wěn)定的allophycocyanin 分子 結(jié)合使用, 促進(jìn)了快速時間分辨熒光技術(shù)的發(fā)展。銪離子與X L665之間通過共振能量轉(zhuǎn)移的方式, 產(chǎn)生特征性的熒光, 且熒光產(chǎn)生的量子效率高, 促進(jìn)了快速均相時間分辨熒光技術(shù)的發(fā)圖4顯示的是熒光增強(qiáng)Eu 3+螯合物的熒光譜。我們連續(xù)改變激發(fā)波長進(jìn)行觀察, 在336337nm 處得到了特征熒光峰(610620nm 的最大值, 即獲得了最佳增強(qiáng)效果(見圖5 。這主要是因為:336337nm 的波長有效地激發(fā)了配位二酮體的單態(tài), 并且在能量轉(zhuǎn)移過程中, 能級間的配合最為恰當(dāng) 。Fig 15The

16、highest effect of fluorescence enhancementby the fluorescent Eu 3+chelate當(dāng)我們選用不同波長的光(300nm 激發(fā)標(biāo)記化合物中的Eu 3+螯合物時(參見圖6 , 發(fā)現(xiàn)Eu 3+的5D J 得到激發(fā), 在熒光譜圖上沒有出現(xiàn)5D 07F J 的特征熒光峰, 直到波長改變到220280nm 時, 才發(fā)現(xiàn)了微弱的4f 組態(tài)的窄峰, 但幾乎被強(qiáng)大的背景熒光所掩蓋, 參見圖6中第6條曲線。這 第5期光譜學(xué)與光譜分析599展。其作用示意圖見圖7。圖7的上部分說明了此種銪離子螯合物的測量法。銪離子吸收337nm 的激發(fā)光后, 通過共振能量

17、轉(zhuǎn)移, 傳給XL665, 發(fā)出665nm 的長壽命熒光, 經(jīng)一段時間的延遲后, 再記錄665nm 熒光的強(qiáng)度, 從而可消除短壽命背景熒光的干擾。圖7的中間部分說明, 當(dāng)XL665為自由狀態(tài)或與銪離子離的較遠(yuǎn)時(一般有效距離不大于915nm 6, 它也發(fā)射665nm 的熒光, 但是熒光的衰變時間很短, 可通過時間延遲克服掉。圖7的下部分說明, 當(dāng)銪離子化合物未與XL665結(jié)合時, 其熒光為620nm 的長壽命的熒光, 通過波長分離與665nm 的熒光區(qū)別開來。6語, 也是20世紀(jì)末配基技術(shù)的重大進(jìn)展, 測定、抗原到激素、藥物, 十分廣泛, 已引起國內(nèi)外7, 8科學(xué)工作者的重視。參1Petters

18、on K et al. Clin. Chem. , 1983, 29:60. 2Eskola J u et al. Clin. Chem. , 1983, 29:1777.3Michelsen B. Analysis and Application of Rare Earth Materials. Oslo :Universitetsforlaget , 1973.4ZHAN G Ruo 2hua (張若樺 . Lanthanide Chemistry (稀土元素化學(xué) . Tianjin Pubhishing Company of Science and Technology (天津科學(xué)技術(shù)出

19、Fig 17Principles of 考文獻(xiàn)版社 , 1987.5Ryan J L. J. Phys. Chem. , 1966, 70:2845.6Dietrich B , Sauvage J 2P. The Nobel Award G oes to Crown Ethers , Cryptands and Other Host 3Guest Molecular Systems. New J. Chem. ,1987, 12:8.7TIAN Zhen , GUO Zhou 2yi et al (田振, 郭周義等 . Acta Laser Biology Sinica (激光生物學(xué)報 , 2

20、002, 11(4 :290. 8TIAN Zhen , GUO Zhou 2yi (田振, 郭周義 . J. Optoelectronics Laser (光電子激光 , 2002, 13(11 :1998.Spectroscopic Evalu ation of Time 2R esolved FluoroimmunoassayGUO Zhou 2yi , TIAN Zhen , J IA Y a 2liInstitute of Laser Life Science , S outh China Normal University , Guangzhou 510631, ChinaAbst

21、ract The lanthanide trivalence ion and its chelates are used for markin g substance in Time 2Resolved Fluorescence Immunoassay(TRFIA , marking protein , hormone , antibody , nucleic acid probe or biologic alive cell , to measure the concentration of the analysis substance inside the reaction system with time 2resolved fluorometry after the reaction system occurred , and attain the quantitative analysis s purpose. TRFIA has therefore become a kind of new and more sensitive measurement method after radioisoto pe marking , enzymatic marking , chemiluminescence ,