實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究        摘要 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上起來(lái)的核酸定量技術(shù),已廣泛應(yīng)用于不同研究領(lǐng)域。論述了熒光定量PCR技術(shù)的基本原理、主要類型和定量實(shí)驗(yàn)方法,探討了實(shí)驗(yàn)條件的控制、影響因素和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方法。 關(guān)鍵詞 熒光定量PCR技術(shù);原理;主要類型;定量方法;優(yōu)化 Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR is a new kind of nucleic acid quantitative techniq

2、ue,which develops in the PCR qualitative technique base. It has been widely used in different research fields. In the paper,the experiment principles,the main types and quantitative methods of this technology were described. The control of experimental conditions,affecting factors and optimization o

3、f experimental results were discussed. Key words real-time fluorescent quantitative PCR;principle;main types;quantitative method;optimizing 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且具有靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)1。目前,該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,特別是在農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物的定性

4、檢測(cè)、品系鑒定、轉(zhuǎn)基因成分含量的檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用2。 1 熒光定量PCR技術(shù)的原理 熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法3。由于常規(guī)PCR無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè),需借助凝膠電泳等手段對(duì)擴(kuò)增終產(chǎn)物進(jìn)行定性和半定量分析,不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)事、易污染,且無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量。熒光定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)隨著反應(yīng)進(jìn)程而變化,每經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng),定量PCR儀收集1個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),通過(guò)熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到1條熒光擴(kuò)增曲線,熒光擴(kuò)增曲線一般由

5、基線、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期組成4。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段,PCR產(chǎn)物熒光信號(hào)的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性對(duì)應(yīng)關(guān)系,才可以在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較,在熒光定量PCR 反應(yīng)的指數(shù)期,需要設(shè)定1個(gè)熒光信號(hào)的閾值(threshold)。熒光閾值是熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值,熒光閾值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,用它可以定義樣本的循環(huán)閾值(Cycle Threshold,Ct)。Ct值是PCR擴(kuò)增過(guò)程中,反應(yīng)管的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)。可見(jiàn),Ct值取決于閾值。經(jīng)數(shù)學(xué)證明5,每個(gè)模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與Ct值存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多

6、,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上出該樣品的起始拷貝數(shù)6。 2 熒光定量PCR技術(shù)的主要類型 熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)材料可分為兩大類,即熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR Green為主要代表,是非特異性熒光化學(xué)材料。熒光探針包括TaqMan、分子信標(biāo)、熒光標(biāo)記引物、雜交探針等,屬于特異性熒光材料。 2.1 SYBR Green SYBR Green是一種能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料。在游離狀態(tài)下,SYBR Green發(fā)出微弱的熒光,但是一旦與雙鏈DNA結(jié)合,其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。因此,一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出現(xiàn)

7、的雙鏈DNA量成正比,可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系中的雙鏈DNA的數(shù)量7。其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)方法簡(jiǎn)單,通用性好,價(jià)格相對(duì)較低,是許多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展熒光定量實(shí)驗(yàn)的首選。SYBR Green的缺點(diǎn)在于它能夠和所有的雙鏈DNA相結(jié)合,因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物引起的熒光信號(hào)會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性。但可以通過(guò)優(yōu)化PCR的反應(yīng)條件、選擇設(shè)計(jì)良好的引物,來(lái)減少或去除引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生;另外,也可以通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線進(jìn)行分析來(lái)判斷熒光信號(hào)的真實(shí)性。 2.2 TaqMan探針 TaqMan探針技術(shù)是有美國(guó)Perkin Elmer(PE)公司研制的一種實(shí)時(shí)PCR定量技術(shù),在PCR擴(kuò)

8、增加入一對(duì)引物的同時(shí)加入1個(gè)特異性的熒光探針,此熒光探針為一個(gè)3045 bp的寡核苷酸,它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì),其5端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán),3端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針保持完整時(shí),3端淬滅基團(tuán)抑制了5端發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。但在PCR擴(kuò)增中,模板變性后低溫退火,引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合,在引物的介導(dǎo)下,沿模板向前延伸至探針結(jié)合處,發(fā)生鏈的置換,Taq DNA聚合酶的53外切酶活性將探針5端連接的熒光發(fā)射基團(tuán)從探針上切割下來(lái),游離于反應(yīng)體系中,從而脫離3'端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽,接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR 產(chǎn)物數(shù)量是相對(duì)應(yīng)關(guān)系,且熒光強(qiáng)度

9、同被釋放的熒光基團(tuán)的數(shù)目也是正比關(guān)系,因此該技術(shù)可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量8。TaqMan探針技術(shù)特異性好、準(zhǔn)確性高、假陽(yáng)性低、重復(fù)性比較好。但是需要設(shè)計(jì)特異性的探針,因此成本較高9。 2.3 分子信標(biāo) 分子信標(biāo)技術(shù)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)狀雙標(biāo)記寡核苷酸探針,環(huán)部與靶DNA序列互補(bǔ),為1535 bp;莖部是由互相配對(duì)的堿基組成,但與靶DNA無(wú)序列同源性,約8 bp。在探針的5端和3端分別標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)溶液中的模板與分子信標(biāo)結(jié)合配對(duì)時(shí),分子信標(biāo)的構(gòu)象改變成鏈狀使得熒光發(fā)射基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi),當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí),就發(fā)出熒光信號(hào)。與探針互補(bǔ)的靶分子數(shù)量越多,熒光信號(hào)也就越強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)了

10、對(duì)目的基因的定量檢測(cè)。分子信標(biāo)的方法優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng),熒光背景低。其缺點(diǎn)是設(shè)計(jì)困難,雜交探針不能完全與模板結(jié)合,穩(wěn)定性較差,價(jià)格高10。 1            3 熒光定量PCR技術(shù)的定量方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該技術(shù),可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量方法包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量。前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度;后者可以對(duì)不同方式處理的2個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。 3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對(duì)定量法 用一系列已知

11、濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,在相同條件下檢測(cè)未知樣品的Ct值,從而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線出未知樣品的濃度(拷貝數(shù))。制作1個(gè)好的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)定量結(jié)果至關(guān)重要,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),應(yīng)至少選擇5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品,涵蓋待測(cè)樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍,最好與目的基因有較高的同源性;絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品通?？梢允羌兓馁|(zhì)粒dsDNA,體外轉(zhuǎn)錄的RNA,或者是體外合成的ssDNA、標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260 nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來(lái)確定。 3.2 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定量法 在某些不需要對(duì)基因進(jìn)行絕對(duì)定量、只需

12、要確定基因相對(duì)表達(dá)差異的情況下,如某基因在經(jīng)過(guò)某種處理后表達(dá)量是增加了還是減少了,用相對(duì)定量的方法就可以得到結(jié)果。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法是指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定某一內(nèi)源性管家基因,并用目的基因和管家基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,處理與未處理樣品同時(shí)擴(kuò)增目的基因和管家基因,獲得Ct值,然后從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出初始模板量,經(jīng)管家基因均一化處理后,求出目的基因的相對(duì)含量。定量的表達(dá)是相對(duì)于某個(gè)參照物的量而言的,因此相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線就比較容易制備,對(duì)所用的標(biāo)準(zhǔn)品不需要知道絕對(duì)拷貝數(shù),只要知道其相對(duì)稀釋度即可。通常選用的管家基因有GAPDH、-actin、2-微球蛋白和rRNA。此方法在擴(kuò)增效率較低、目標(biāo)

13、基因與管家基因擴(kuò)增效率有差異時(shí)適用,且需要很精確的結(jié)果計(jì)算。 3.3 比較Ct法的相對(duì)定量法 如果反應(yīng)條件控制較好,擴(kuò)增效率較高,目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率基本一致,這時(shí)就不需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線,而是通過(guò)與管家基因Ct值之間的相差來(lái)計(jì)算目的基因的表達(dá)差異。比較Ct法運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量,前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加1倍的產(chǎn)物量,根據(jù)數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出: 目的基因的量=2-C t 在該公式中,Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照組。因此,2-C t表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù),使用這一方法可以直接得到的目的基因相對(duì)于管家基因的定量,而不必制作

14、標(biāo)準(zhǔn)曲線11。 4 熒光定量PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 定量PCR技術(shù)已經(jīng)在生物學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用,技術(shù)也日臻完善,并且敏感度極高,特異性強(qiáng);正因?yàn)槊舾卸雀?很容易受其他因素的影響,因此要得到準(zhǔn)確可靠的反應(yīng)結(jié)果,必須根據(jù)不同的反應(yīng)類型優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,如特異性探針及引物的設(shè)計(jì)、選擇合適的Mg2+濃度、引物和探針濃度、循環(huán)數(shù)等,規(guī)范操作步驟,并仔細(xì)配制PCR反應(yīng)體系。 4.1 引物及探針 一是設(shè)計(jì)要求。引物設(shè)計(jì)是實(shí)時(shí)定量PCR中最重要的一步,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度根據(jù)技術(shù)的不同有所區(qū)別:SYBR greenI技術(shù)要求擴(kuò)增片段不大于500 bp,Taq Man探針技術(shù)要求擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在50150 bp。引物

15、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段并具有特異性,長(zhǎng)度一般為1824 bp,避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì),引物自身不能形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu),熔解溫度Tm值在5565 ,GC含量在40%60%,上、下游引物之間的Tm值相差不要超過(guò)4 。在Taqman探針的設(shè)計(jì)上要求絕對(duì)保守,長(zhǎng)度為3045 bp,Tm值在6870 ,探針的5端不能為G和避免多個(gè)堿基同時(shí)出現(xiàn),探針應(yīng)盡可能靠近上游引物。二是濃度。引物和探針的濃度也會(huì)影響反應(yīng)的特異性,引物濃度太低會(huì)致使反應(yīng)不完全,引物濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。最佳的引物濃度一般在0.10.6 moL/L,探針的濃度在0.050.30 moL/L,可以在

16、這個(gè)基礎(chǔ)上再進(jìn)一步優(yōu)化,以達(dá)到引物探針整體的最佳濃度。三是穩(wěn)定性。一般從生物技術(shù)公司定制引物是以干粉形式運(yùn)輸?shù)?使用時(shí)最好用TE溶液溶解,使其最終濃度為100 moL/L,-20 保存。純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高,且保存時(shí)間可以長(zhǎng)達(dá)1年以上。由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解,在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下,最好稀釋成2 moL/L(10×),作為工作濃度分裝多支,避光保存。四是退火溫度。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm值低5。在理想狀態(tài)下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火;同時(shí)還要足夠高,以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度一般為5570 。 4.2 模板質(zhì)量與濃度 模板的質(zhì)量會(huì)

17、影響PCR擴(kuò)增的效率。模板應(yīng)在-20 保存,避免反復(fù)凍融。用TE溶液溶解和稀釋模板,這能大大延長(zhǎng)保質(zhì)期。模板濃度應(yīng)根據(jù)Ct值選擇,使Ct值位于1530個(gè)循環(huán)比較合適,若Ct值大于30,則應(yīng)提高的模板濃度;如果小于15,則應(yīng)降低的模板濃度。 4.3 鎂離子濃度 Mg2+是影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素。Mg2+的濃度過(guò)高,會(huì)增加非特異性擴(kuò)增,降低忠實(shí)性;Mg2+的濃度過(guò)低影響Taq酶發(fā)揮最佳活性。一般來(lái)說(shuō),對(duì)以DNA或cDNA為模板的PCR反應(yīng),應(yīng)選擇25 mmoL/L濃度的Mg2+。 4.4 循環(huán)數(shù) 一般的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)只需2530個(gè)循環(huán)便可獲得滿意的結(jié)果,但是對(duì)于那些極微量的待測(cè)樣本而言,適

18、當(dāng)增加循環(huán)數(shù)可以提高反應(yīng)的檢出底限,建議循環(huán)數(shù)為40個(gè),但是并非循環(huán)數(shù)增加的越多,其敏感性就會(huì)越高。實(shí)際上,當(dāng)循環(huán)數(shù)增加到某一值時(shí),敏感性便不再升高。 4.5 重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性、陽(yáng)性對(duì)照 定量實(shí)驗(yàn),誤差是不可避免的,設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,可以將誤差降低到最小,因此定量實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣本至少要重復(fù)3次以上。為了增加PCR擴(kuò)增反應(yīng)的可信度,在擴(kuò)增的同時(shí),需進(jìn)行陰性、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)。陰性反應(yīng)中不加模板DNA,而以水或緩沖液代替,用于檢驗(yàn)是否存在PCR污染。陽(yáng)性對(duì)照則用于檢驗(yàn)PCR試劑和實(shí)驗(yàn)操作上可能出現(xiàn)的問(wèn)題。相對(duì)來(lái)說(shuō),儀器、PCR 試劑、SYBR Green染料是很穩(wěn)定的,而操作和模板是薄弱環(huán)

19、節(jié),模板的加入量一定要準(zhǔn)確,為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性,每個(gè)樣品至少平行做3次重復(fù)。使用微量移液器時(shí),如果不仔細(xì),就會(huì)產(chǎn)生較大的用量誤差甚至錯(cuò)誤。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)避免室溫下混合各種試劑,應(yīng)在冰上進(jìn)行,避免所配體系產(chǎn)生氣泡,并且在一經(jīng)混合后立即開(kāi)始進(jìn)行擴(kuò)增。 5 結(jié)語(yǔ) 通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因的特異性引物和探針,并優(yōu)化反應(yīng)體系和控制反應(yīng)條件,可以成功地建立快速、靈敏、特異的熒光定量PCR檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)大樣本同時(shí)檢測(cè),節(jié)省大量的時(shí)間和反應(yīng)成本。隨著基因技術(shù)的,熒光定量PCR技術(shù)將會(huì)深入和拓展,在農(nóng)業(yè)中得到更廣泛的應(yīng)用。 6 1 MIKAEL K A,JOSE M A,MARTIN B,et al.The

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