周圍神經(jīng)缺血后相關(guān)神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)生長(zhǎng)因子動(dòng)態(tài)變化的研究

1、周圍神經(jīng)缺血后相關(guān)神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)生長(zhǎng)因子動(dòng)態(tài)變化的研究【摘要】 目的 探討大鼠坐骨神經(jīng)缺血后相關(guān)脊髓節(jié)段和背根節(jié)神經(jīng)元的凋亡及神經(jīng)生長(zhǎng)因子（ngf）表達(dá)的變化，以期為周圍神經(jīng)缺血性神經(jīng)病的機(jī)制及臨床治療提供理論依據(jù)。方法 結(jié)扎大鼠單側(cè)髂總動(dòng)脈制作坐骨神經(jīng)缺血模型，分別于術(shù)后3、5、7、14、21、28 d用4%多聚甲醛灌流固定，取腰髓l46節(jié)段和雙側(cè)第46腰脊神經(jīng)節(jié)固定，分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)及tunel染色檢測(cè)神經(jīng)元的ngf和凋亡表達(dá),同體對(duì)照。結(jié)果 坐骨神經(jīng)缺血的不同時(shí)間段l46脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及背根節(jié)神經(jīng)元可見(jiàn)凋亡神經(jīng)元細(xì)胞，背根節(jié)神經(jīng)元凋亡率術(shù)后3 d時(shí)顯著性升高，術(shù)后7 d時(shí)達(dá)到峰

2、值后緩慢下降，后期接近對(duì)照側(cè)水平。腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在術(shù)后5 d時(shí)開(kāi)始有顯著性提高，14 d時(shí)達(dá)到最大值后逐漸下降，后期較對(duì)照側(cè)仍顯著性增高。腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及背根節(jié)神經(jīng)元ngf的表達(dá)5 d時(shí)陽(yáng)性率較對(duì)照側(cè)開(kāi)始顯著降低，7 d時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)后逐漸復(fù)原，至術(shù)后28 d時(shí)與對(duì)照側(cè)無(wú)明顯差異。結(jié)論 周圍神經(jīng)缺血性損傷導(dǎo)致相關(guān)神經(jīng)元胞體中ngf含量減少，與神經(jīng)元凋亡相關(guān)。缺血性損傷對(duì)背根節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元的影響較脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)明顯?！娟P(guān)鍵詞】 大鼠 坐骨神經(jīng) 神經(jīng)元 缺血 凋亡 ngf有研究表明，周圍神經(jīng)損傷將不可避免引起相應(yīng)節(jié)段脊髓和背根節(jié)神經(jīng)元的死亡，凋亡是受損神經(jīng)元死亡的重要形式之一1-4。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

3、不僅對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的功能，而且對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞也有保護(hù)、預(yù)防變性和促進(jìn)再生的功能。周圍神經(jīng)缺血可導(dǎo)致缺血神經(jīng)纖維變性，軸突運(yùn)輸速度減慢或停止，相關(guān)神經(jīng)元胞體逆行性變性5，6。周圍神經(jīng)缺血所致相關(guān)神經(jīng)元胞體變性或死亡，是否由于神經(jīng)元胞體攝取某種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不足而導(dǎo)致其程序化死亡，筆者尚未見(jiàn)有報(bào)道證明。本研究通過(guò)建立周圍神經(jīng)缺血模型，觀察缺血神經(jīng)相應(yīng)脊髓節(jié)段前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及背根節(jié)神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（ngf）的表達(dá)變化及神經(jīng)元在不同時(shí)期凋亡表達(dá)的變化，分析其相互變化的關(guān)系，為探索臨床缺血性神經(jīng)病的機(jī)制、預(yù)后和治療提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 動(dòng)物分組及模型制備 選用成年健康wi

4、star大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)04057)30只，雌雄不限，體重200250 g，按手術(shù)先后隨機(jī)分為3、5、7、14、21、28 d共6組，每組5只。隨機(jī)選擇動(dòng)物的一側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)，另一側(cè)為對(duì)照側(cè)。用2%苯巴比妥（100 mg/kg）作腹腔麻醉，腹部剃毛，無(wú)菌操作下取中腹正中切口或旁正中切口進(jìn)腹，顯露實(shí)驗(yàn)側(cè)髂總動(dòng)脈，雙重結(jié)扎，造成實(shí)驗(yàn)側(cè)坐骨神經(jīng)缺血。逐層縫合腹部切口，消毒，動(dòng)物清醒后分籠，常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于術(shù)后不同時(shí)間組，以10%烏拉坦（1g/kg）行腹腔麻醉，開(kāi)胸，升主動(dòng)脈插管，用0.9%氯化鈉溶液快速灌流， 4%多聚甲醛0.1 moll、pbs固定液（ph值7.

5、4）300 ml灌注固定。經(jīng)后入路取與坐骨神經(jīng)相關(guān)的l46節(jié)段和雙側(cè)第46腰脊神經(jīng)節(jié)，置于同樣固定液中，固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5 m，每隔20張取4張分別貼于涂有apes的載玻片上，以此法每組標(biāo)本收集4套切片烤干備用。 1.2 試劑來(lái)源 ngf抗體，sp試劑盒，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，dab顯色劑，胰酶消化液均購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司（santa cruze biotechnology 公司產(chǎn)品）。 1.3 免疫組化染色步驟 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,用pbs（0.01 moll，ph值7.4）浸泡沖洗3次, 3%過(guò)氧化氫甲醇液，室溫下孵育30

6、min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性,3%正常羊血清封閉1 h(37)，滴加稀釋后（1100）的一抗ngf（兔igg多抗），4冰箱濕盒內(nèi)過(guò)夜（20 h），滴加生物素標(biāo)記的二抗（羊抗兔igg），37恒溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min。 滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈卵白素工作液，37恒溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min，dab顯色，蘇木精復(fù)染。常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封固。在光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)各組手術(shù)側(cè)陽(yáng)性前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量。 1.4 原位末端標(biāo)記技術(shù)（tunel法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡 操作過(guò)程：切片用二甲苯常規(guī)脫蠟，用蛋白酶k（20 g/ml）消化，滴平衡緩沖液，37恒溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min，滴加tunel反應(yīng)

7、混合物，37恒溫箱濕盒內(nèi)孵育60 min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗熒光素抗體（轉(zhuǎn)化劑pod），37恒溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min。 dab顯色，蘇木精復(fù)染。沖洗、透明、封片。陰性對(duì)照以pbs替代tunel反應(yīng)混合物。陽(yáng)性對(duì)照先用dna酶作用，再行上述操作。鏡下觀察標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞。 1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) 腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元計(jì)數(shù)在顯微鏡200倍下進(jìn)行，各時(shí)間組的標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)10張切片，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率及凋亡百分率。設(shè)缺血與否，缺血時(shí)間，細(xì)胞因子。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用spss 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以s表示，采用對(duì)結(jié)果進(jìn)行析因設(shè)計(jì)的方

8、差分析，分析時(shí)間與缺血之間的交互作用，用duncan 法作缺血情況下不同時(shí)間組均數(shù)間的比較，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 tunel法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡的結(jié)果 實(shí)驗(yàn)側(cè)腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元于術(shù)后3 d時(shí)無(wú)明顯變化，5 d時(shí)凋亡率顯著升高，于術(shù)后14 d神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率達(dá)到峰值后隨時(shí)間進(jìn)展逐漸降低，至術(shù)后28 d時(shí)仍高于對(duì)照側(cè)。實(shí)驗(yàn)側(cè)背根節(jié)神經(jīng)元于術(shù)后3 d時(shí)陽(yáng)性率比對(duì)照側(cè)顯著性升高，術(shù)后7 d時(shí)達(dá)到峰值后隨時(shí)間逐漸降低，至術(shù)后28 d時(shí)與對(duì)照側(cè)無(wú)顯著性差異，背根節(jié)神經(jīng)元凋亡率升高幅度較腰髓明顯。凋亡的神經(jīng)元在背根節(jié)中多散在分布于周邊部分，在腰髓前角中散在分布。凋亡神

9、經(jīng)元胞體腫脹或縮小，細(xì)胞核致密，偏位，呈棕黃色或深黃色，部分神經(jīng)元固縮、變小呈三角形。術(shù)后對(duì)照側(cè)腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及背根節(jié)神經(jīng)元罕有陽(yáng)性表達(dá)。 析因方差分析結(jié)果顯示，fa= 438.109，fb= 62.859，fab= 438.109，p0.01，在背根節(jié)fa= 669.873，fb= 60.864，fab= 54.080，p0.01，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)側(cè)腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及背根節(jié)神經(jīng)元凋亡率的表達(dá)與對(duì)照側(cè)是不同的，缺血后不同時(shí)間的表達(dá)亦不相同，缺血情況與時(shí)間對(duì)神經(jīng)元凋亡的表碉有交互作用（實(shí)驗(yàn)側(cè)不同時(shí)間腰髓前角神經(jīng)元及背根節(jié)神經(jīng)元的凋亡率及不同時(shí)間組相互間兩兩比較結(jié)果見(jiàn)表14，圖1、2)。表1 2側(cè)不

10、同時(shí)間腰髓前角神經(jīng)元神經(jīng)元的凋亡率比較表2 實(shí)驗(yàn)側(cè)不同時(shí)間組腰髓前角神經(jīng)元神經(jīng)元的凋亡率兩兩比較結(jié)果 注：*p0.05，#p0.01 2.2 ngf免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 實(shí)驗(yàn)側(cè)的腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元ngf表達(dá)陽(yáng)性率在術(shù)后3 d時(shí)無(wú)顯著性變化,術(shù)后5 d時(shí)與對(duì)照側(cè)比較開(kāi)始有顯著性降低, 隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)降低程度增大，術(shù)后7 d時(shí)達(dá)最低點(diǎn)，后逐漸回升，術(shù)后28 d時(shí)陽(yáng)性率接近對(duì)照側(cè)。背根節(jié)神經(jīng)元ngf表達(dá)陽(yáng)性率變化趨勢(shì)與腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相同，但背根節(jié)神經(jīng)元ngf陽(yáng)性表達(dá)率降低幅度較腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元明顯。表3 2側(cè)不同時(shí)間腰髓背根節(jié)神經(jīng)元的凋亡率比較表4 實(shí)驗(yàn)側(cè)不同時(shí)間腰髓背根節(jié)神經(jīng)元凋亡率比較注

11、：*p0.05，#p0.01 免疫組化染色陽(yáng)性的細(xì)胞多為中、小型神經(jīng)元。免疫反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，彌漫分布于胞漿中，大小不等，細(xì)胞核染色結(jié)果為陰性，核仁無(wú)陽(yáng)性染色，部分神經(jīng)髓鞘著色。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)照側(cè)神經(jīng)元形態(tài)正常，大小細(xì)胞均可見(jiàn)免疫反應(yīng)性染色，實(shí)驗(yàn)側(cè)部分神經(jīng)元胞體腫脹，核偏位。表5 坐骨神經(jīng)缺血后腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元ngf的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果 析因方差分析結(jié)果顯示，在腰髓fa=144.258，fb=16.916，fab= 14.635，p0.01，在背根節(jié)fa= 307.249，fb= 41.462，fab= 33.454，p0.01，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)側(cè)腰髓前角神經(jīng)元及背根節(jié)神經(jīng)元ngf的表達(dá)與對(duì)照側(cè)是不同的

12、，實(shí)驗(yàn)側(cè)不同時(shí)間ngf的表達(dá)亦不相同，缺血情況與時(shí)間對(duì)ngf的表達(dá)存在交互作用（缺血情況下不同時(shí)間腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及背根節(jié)神經(jīng)元ngf的表達(dá)陽(yáng)性率及不同時(shí)間組比較結(jié)果見(jiàn)表58，圖3、4。表6 實(shí)驗(yàn)側(cè)不同時(shí)間組腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元ngf的表達(dá)陽(yáng)性率比較結(jié)果表7 坐骨神經(jīng)缺血后腰髓l46背根節(jié)神經(jīng)元ngf的陽(yáng)性表達(dá)表8 實(shí)驗(yàn)側(cè)不同時(shí)間組腰髓l46 背根節(jié)神經(jīng)元ngf的表達(dá)陽(yáng)性率兩兩比較結(jié)果 3 討論 細(xì)胞凋亡是神經(jīng)元死亡的基本形式。發(fā)育過(guò)程中的神經(jīng)元是否與外界靶器官有接觸，是否建立了神經(jīng)調(diào)控通路，是決定神經(jīng)元是否發(fā)生凋亡的一種重要原因。切斷成年大鼠的坐骨神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)中，可在腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和背根節(jié)

13、神經(jīng)元中見(jiàn)到凋亡細(xì)胞，感覺(jué)神經(jīng)元死亡占29%，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡占41%7-10。實(shí)驗(yàn)表明，坐骨神經(jīng)外血管系的缺血可以引起其相關(guān)腰髓節(jié)段和背根節(jié)部分神經(jīng)元胞體超微結(jié)構(gòu)的變化，術(shù)后714 d時(shí)變化明顯，核周粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，排列紊亂，線粒體腫脹、嵴斷裂，數(shù)目減少，變形嚴(yán)重的核膜溶解、破裂，細(xì)胞體積縮小11。細(xì)胞器的減少及其病理變化，使神經(jīng)元處于低功能狀態(tài)，不能合成充分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供軸突修復(fù)再生需要。神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果與用原位tunel標(biāo)記染色結(jié)果變化相互吻合。背根節(jié)神經(jīng)元早期凋亡表達(dá)率即明顯升高,術(shù)后7 d時(shí)達(dá)峰值，后逐漸緩慢下降接近對(duì)照側(cè)水平。腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在早期凋亡表達(dá)率開(kāi)始顯著升高，術(shù)后

14、14 d時(shí)達(dá)到峰值，后逐漸緩慢下降，術(shù)后28 d時(shí)仍較對(duì)照側(cè)顯著性升高。說(shuō)明腰髓節(jié)段前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元出現(xiàn)損傷表現(xiàn)的時(shí)間較背根節(jié)神經(jīng)元晚，但損傷持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)，損傷呈漸進(jìn)性。背根節(jié)神經(jīng)元凋亡表達(dá)率增高幅度大，神經(jīng)元丟失較多，說(shuō)明缺血性損傷對(duì)背根節(jié)神經(jīng)元影響大，本研究結(jié)果與臨床上缺血性神經(jīng)病的表現(xiàn)相符，早期出現(xiàn)感覺(jué)障礙，癥狀持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，感覺(jué)功能難以恢復(fù)。 ngf為靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，逆行沿軸突運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的作用12-17。神經(jīng)元在創(chuàng)傷后接受ngf受體介導(dǎo)的ngf的營(yíng)養(yǎng)支持作用，維持神經(jīng)元的生存和軸突的再生。我們的實(shí)驗(yàn)表明，周圍神經(jīng)缺血后，其相關(guān)的腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和背根節(jié)神經(jīng)元胞體中n

15、gf表達(dá)陽(yáng)性率降低，早期降低不明顯，可能是軸突損傷程度較輕，神經(jīng)元尚可從周圍組織及靶器官得到足夠的ngf，術(shù)后5 d時(shí)ngf表達(dá)量開(kāi)始顯著性降低，7 d時(shí)達(dá)到最低值，說(shuō)明隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)軸突的損傷程度逐漸加重，神經(jīng)元能夠獲得的ngf含量逐漸減少，背根節(jié)神經(jīng)元中ngf表達(dá)陽(yáng)性率較腰髓前角神經(jīng)元下降明顯，說(shuō)明背根節(jié)神經(jīng)元較脊髓前角神經(jīng)元易受損，此結(jié)果與臨床感覺(jué)神經(jīng)的易損性相一致。 在切斷坐骨神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)中，斷端給予神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可減少神經(jīng)元的凋亡，再生軸突數(shù)目增多18。周圍神經(jīng)缺血后缺血部位在神經(jīng)纖維而不在神經(jīng)元胞體，神經(jīng)元胞體發(fā)生凋亡與缺血后神經(jīng)纖維軸突損傷引起的神經(jīng)元胞體生存所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，特

16、別是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的減少有密切相關(guān)，凋亡細(xì)胞量的多少與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子量的多少密切相關(guān)。缺血損傷后ngf在神經(jīng)元中的表達(dá)主要表現(xiàn)為減少，腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和背根節(jié)神經(jīng)元凋亡的高峰期與其ngf表達(dá)的最低時(shí)段相符合，說(shuō)明ngf對(duì)神經(jīng)元正常形態(tài)、功能、生化代謝和生存有重要意義。脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡率較低與脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元同其他神經(jīng)元及組織聯(lián)系廣泛，軸樹(shù)突較多，相互間關(guān)聯(lián)密切有關(guān)。背根節(jié)神經(jīng)元凋亡率高說(shuō)明感覺(jué)神經(jīng)元有易損性，感覺(jué)神經(jīng)元中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的來(lái)源對(duì)靶器官的依賴性較大。 臨床上由各種因素造成引起周圍神經(jīng)缺血的疾病較多，短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙，所支配的肢體感覺(jué)減退，肌張力減弱，當(dāng)傳導(dǎo)功能完全喪失則支配區(qū)感覺(jué)完全喪失。受累的部位運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能障礙，其程度與缺血程度相平行，大多預(yù)后較差。神經(jīng)功能的恢復(fù)涉及到神經(jīng)元軸突幾效應(yīng)器。神經(jīng)元的凋亡，數(shù)量的減少將影響神經(jīng)的再生。因此在缺血損傷的早期如何保護(hù)好神經(jīng)元是一項(xiàng)十分重要的課題，將對(duì)臨床缺血性神經(jīng)病治療和預(yù)后有重要的意義。【參考文獻(xiàn)】 1 kerr jf，wyllie all，curriear. apoptosis: a basic biological ph