實時熒光定量PCR檢測陰道加德納菌的方法與應用

1、實時熒光定量PCR檢測陰道加德納菌的方法與應用                    作者：陳麗 李紅海 魯勇 李向陽 楊錦紅 【摘要】  目的：建立檢測陰道加德納菌的實時熒光定量PCR方法，用于細菌性陰道病的診斷。方法：按照Amsel診斷標準診斷細菌性陰道??；定性PCR檢測患者陰道分泌物中的陰道加德納菌；實時熒光定量PCR測定患者陰道分泌物中的陰道加德納菌的DNA含量，同時測定標本中總的細菌16

2、Sr RNA的DNA含量進行校正，即用陰道加德納菌的DNA含量/16Sr RNA的DNA含量比值來表示陰道加德納菌的相對含量。用受試者工作曲線(ROC)評價對細菌性陰道病的診斷價值。結(jié)果：定性PCR的特異度為31.9%，敏感度為93.2%。實時熒光定量PCR檢測陰道加德納菌含量的線性范圍1×101×105拷貝數(shù)/ml。陰道加德納菌在細菌性陰道病中的相對含量為0.561 340 0，明顯高于霉菌性陰道炎（P0.01）、其他陰道炎(P0.01)及健康體檢者(P0.01)，但與滴蟲性陰道炎無明顯差異（P0.05）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，曲線下面積（AUCROC）為0.909，當

3、陰道加德納菌的DNA含量/16Sr RNA的DNA含量的截斷值為0.102 603 5時，其診斷細菌性陰道病的總體敏感度和特異度分別為92.9%和80.3%。結(jié)論：實時熒光定量PCR檢測陰道加德納菌的方法敏感度和特異度較高，準確性和重復性良好。對細菌性陰道病的診斷有一定的臨床應用價值。 【關(guān)鍵詞】  陰道加德納菌 細菌性陰道病 實時熒光定量PCR 診斷價值細菌性陰道病(bacterial vaginosis,BV) 是育齡期婦女常見疾病。在BV患者與健康婦女中,陰道加德納菌( gardnerella vaginalis ,GV)檢出率存在明顯差異。在BV的微生物菌群中GV處于優(yōu)勢地位

4、,數(shù)量明顯高于其他非正常菌群1。目前對陰道加德納菌的實驗室診斷主要有直接涂片革蘭染色找線索細胞、細菌分離培養(yǎng)、免疫熒光法以及PCR 等24。本實驗建立檢測陰道加德納菌的實時熒光定量PCR實驗診斷方法，用于細菌性陰道病的快速診斷。   1  資料與方法    1.1  研究對象  2008年3月2008年5月在本院婦科門診就診者141例,通過鹽水濕片法對陰道分泌物進行檢查，按照Amsel診斷標準:陰道pH值4.5；陰道分泌物增多、稀薄、有異味；陰道分泌物加10%KOH可聞到魚腥味；涂片可見線索細胞。以上4項指標中3項

5、陽性者判定為BV，共44例。滴蟲性陰道炎12例，霉菌性陰道炎25例，其他陰道炎30例，健康體檢者30名?；颊撸ǔ饨】刁w檢者）主訴有程度不同的陰道分泌物異常，外陰瘙癢，泌尿系癥狀及腰痛和下腹痛等癥狀，病程為310天,年齡2350歲,均已婚未孕，就診前3天無陰道灌洗和用藥。月經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女除外。   1.2  主要試劑與儀器  DNA聚合酶及其緩沖液、Mg2、dNTPs、RNA酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(大連寶生物有限公司)，低溫離心機，普通PCR儀（美國ABI公司 DNA Thermal cycler），瓊脂糖凝膠電

6、泳儀（北京六一儀器廠，DYCP31D型），凝膠照像系統(tǒng)（上海復日科技公司），DU紫外分光光度儀（美國Beckman 公司），ABI7500PCR儀（美國ABI公司）。   1.3  引物設(shè)計與合成  陰道加德納菌的引物合成參照文獻,序列如下:上游引物：5TTACTGGTGTATCACTGTAAGG3,下游引物：5CCGTCACAGGCTGAACAGT3；16Sr RNA的引物合成參照文獻，序列上游引物：5AGGAGGTGATCCAACCGCA3,下游引物：5AACTGGAGGAAGGTGGGGAT3，由上海生物有限公司合成。   1.

7、4  模板制備  將溶于0.5ml無菌生理鹽水的陰道分泌物，13000g/min離心30min,棄上清，加入400l溶菌酶裂解液5mmol/L NaCl，20mmol/L TrisHCl (pH 8.0)，1mmol/L EDTA，8%蔗糖，10mg/ml溶菌酶，置37水浴箱20min；加入500g/ml RNA酶10l，置37水浴箱10min；加入100l 10%十二烷基硫酸鈉，置37水浴箱30min；用飽和酚/氯仿/異戊醇抽提上層水相3次，經(jīng)預冷無水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫風干，最終溶解于20l的TE緩沖液中，置-20保存?zhèn)溆谩?#160; 

8、; 1.5  PCR擴增  PCR反應體系為10×buffer2.5l，dNTPs(各2.5 mmol/L)2l，TAKARA Taq（5U/l）0.125l,MgCl2(25 mmol/L)1.5l,上下游引物分別各為0.5l（20mol/L）,模板為3l，用雙蒸水補足至25l（50l體系為各種成分體積增加1倍）。PCR循環(huán)參數(shù)為：94預變性5min，94 45s、55 45s、72 1min,35個循環(huán)，最后72 5min結(jié)束反應(陰道加德納菌和16Sr RNA的循環(huán)參數(shù)相同)。   1.6  標準品DNA制備  從PC

9、R擴增出的GV的DNA片段和16Sr RNA的DNA片段用PCR純化試劑盒進行純化。純化后用紫外分光光度計測其OD260/280及其濃度。用雙蒸水將其濃度調(diào)整，稀釋成不同濃度梯度相當于1×1051×10拷貝數(shù)的標準品并繪制標準曲線。同時對純化后的產(chǎn)物進行測序(大連寶生物有限公司）。   1.7  熒光定量PCR  反應體系為20l，包括：SYBR Premix Ex Taq(2×)10l,上下游引物各為0.2l（20mmol/L），ROX Refence DyeII(50×)0.4l,DNA模板2.0l，用雙蒸水補

10、足至20l。PCR循環(huán)使用兩步法，具體參數(shù)為:95 10s，一個循環(huán);95 5s,55 34s,40個循環(huán)。最后95 15s,60 1 min,95 15s,做溶解曲線（陰道加德納菌和16SrRNA的循環(huán)參數(shù)相同）。   1.8  熒光定量PCR結(jié)果計算  調(diào)節(jié)基線至適宜處,各熒光曲線與基線的交叉點即為Ct（Cycle Threshold）值，根據(jù)標準曲線上的濃度和Ct值的對應關(guān)系,可求出各待測標本的初始濃度。   1.9  重復性試驗  對高、中、低不同濃度的DAN模板連續(xù)5次進行熒光定量PCR反應，每次各濃度做

11、5個平行管，計算試驗內(nèi)以及試驗間Ct的變異系數(shù)。   1.10  統(tǒng)計分析  使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，各組間GV/16Sr RNA的DNA含量差異均用MannWhitney U秩和檢驗分析。BV組作為測定組，非BV組（包括滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎、其他陰道炎及與健康體檢者）作為參照組，將兩組的檢測結(jié)果用ROC曲線進行統(tǒng)計學分析，用來評價檢驗性能。            2  結(jié)  果    2.1&

12、#160; 定性PCR測定結(jié)果  對141份標本進行GV基因片段普通PCR，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，可見332 bp左右的特異性條帶，見圖1。對其進行序列分析，結(jié)果進行Blast同源性比較，擴增DNA片段與L08167序列符合率為100%。其中依照Amsel診斷標準，44份確診為BV的標本中GV陽性41份，12份陰道滴蟲標本中GV陽性8份，25份陰道霉菌病標本中GV陽性21份，30份其他陰道炎標本中GV陽性25份，30份健康體檢者標本中GV陽性12份。由此可知，其特異度為31.9%，敏感度93.2%，準確度51.1%，陽性結(jié)果的預測值為38.3%，陰性結(jié)果的預測值為91.

13、2%，見表1。表1  14份標本定性PCR檢測結(jié)果份   2.3  重復性試驗  取高、中、低3種濃度的樣本A、B、C，分別重復測定5次，測其批內(nèi)CV%值分別為2.69%、1.51%、1.12%；再連續(xù)5天測定，其批間CV%值為1.83%、1.22%、1.20%，表明本方法的批內(nèi)和批間重復性均較好，見表2。圖2  GV的標準曲線圖圖3  16Sr RNA的標準曲線圖表2  實時熒光定量PCR檢測GV的重復性   2.4  各組標本中GV/16Sr RNA的DNA含量比較  G

14、V在BV中的水平明顯高于霉菌性陰道炎、其他陰道炎及健康體檢者（P0.05），但與滴蟲性陰道炎無明顯差異（P0.05），見表3。表3  各組標本中GV/16Sr RNA的測定結(jié)果標本來源n/例GV含量   2.5  GV/16Sr RNA的ROC曲線分析  BV組和非BV組共107例，其中BV組41例，GV/16Sr RNA水平0.102 603 5者為陽性38例，0.102 603 5者為陰性3例；非BV組66例，GV/16Sr RNA陽性13例，GV/16Sr RNA陰性53例，見圖4。曲線下面積為0.909，標準誤為0.027，敏感度為92

15、.9%，特異度為80.3%，準確度為85%，陽性預測值為74.5%，陰性預測值為91.4%,陽性似然比為4.69，陰性似然比為0.25。   3  討  論    BV是陰道內(nèi)乳酸桿菌被另一組有特點的細菌所取代，同時伴有陰道分泌物性質(zhì)改變的一組綜合圖4  GV/16SrRNA的比值診斷細菌性   陰道病的受試者工作曲線征。通過定性PCR的結(jié)果可知，PCR的特異性為31.9%(31/97)，敏感度93.2%（41/44）。一方面本方法中BV患者和健康體檢者的GV檢出率比李連青等的檢出率高，可能是使

16、用了不同的檢測方法；PCR法具有較高的敏感度但是特異度相對較低,主要原因為陰道加德納菌為陰道內(nèi)寄居菌，BV、滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎、其他陰道炎患者及健康體檢者中均能檢測到此菌，因此，不能僅通過普通PCR對BV進行診斷，需采用定量研究。   本實驗建立了實時熒光定量PCR檢測GV的方法，具有準確、靈敏、特異、簡單等特點，且重復性好，批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為1.1%2.7%、1.2%1.9%。   本實驗標本的采集中有很多重要的因素需要考慮，如樣本選取部位的不同、獲得量的不同等，這些都會影響實時熒光定量PCR檢測GV的DNA含量。為了避免這些問題，筆者用

17、總的細菌16Sr RNA的DNA含量進行校正，即GV的DNA含量/16Sr RNA的DNA含量的比值作為GV的DNA含量。   本研究對BV、滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎、其他陰道炎和健康體檢者陰道分泌物標本中的GV和16Sr RNA的DNA含量進行了定量分析。結(jié)果BV組中GV的DNA含量較霉菌性陰道炎，其他陰道炎和健康體檢者顯著增高（P0.05），這說明GV作為BV的診斷具有較好的特異性。但是與滴蟲性陰道炎無顯著差異（P=0.058），可能原因為滴蟲性陰道炎感染的同時合并細菌性陰道病感染，或滴蟲性陰道炎感染導致GV含量的增加，這些還需進一步研究證實。   ROC曲線分析結(jié)果顯示，曲線下面積（AUCROC）=0.909（95%可信區(qū)間:0.8570.962），當截斷值為0.102 603 5時，GV/16Sr RNA的敏感度和特異度分別為92.9%和80.3%。Amsel標準作為臨床診斷BV最常用的標準，經(jīng)鹽水濕片法，診斷為BV的44