HBV-DNA熒光定量PCR檢測的室內(nèi)質(zhì)控研究

1、HBV-DNA熒光定量PCR檢測的室內(nèi)質(zhì)控研究    作者：呂虹 周亞莉 張國軍 方芳 王雅杰 閆惠平 康熙雄作者單位：首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院實驗診斷中心，北京 100050； 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染與免疫中心，北京 100069 【摘要】 目的 研究HBV-DNA熒光定量PCR檢測室內(nèi)質(zhì)控管理體系。 方法 自     作者：呂虹 周亞莉 張國軍 方芳 王雅杰 閆惠平 康熙雄    作者單位：首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院實驗診斷中心，北京 100050； 首都

2、醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染與免疫中心，北京 100069   【摘要】  目的 研究HBV-DNA熒光定量PCR檢測室內(nèi)質(zhì)控管理體系。 方法 自制HBV-DNA陽性質(zhì)控血清，連續(xù)測量20次，計算均值、標準差和變異系數(shù)，從第3次開始利用即刻法進行質(zhì)控，20次以后利用質(zhì)控圖法進行質(zhì)控。 結(jié)果 自制陽性質(zhì)控血清均一性和準確度均達到實驗要求，用即刻法檢測320次質(zhì)控結(jié)果均小于N2S數(shù)值，在控制范圍內(nèi)，用質(zhì)控圖法檢測HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控對數(shù)值的均值為5.54，標準差為0.22，CV為3.9%，穩(wěn)定性好，有臨床應用價值，質(zhì)控圖利用EXCEL表格標示出警告限和失控限，有利于動態(tài)監(jiān)控質(zhì)

3、控結(jié)果。 結(jié)論 聯(lián)合即刻法和質(zhì)控圖法對于應用熒光定量PCR的方法進行HBV-DNA檢測的室內(nèi)控制切實可行。 【關鍵詞】  乙肝-DNA 熒光定量 室內(nèi)質(zhì)控 即刻法 質(zhì)控圖 隨著臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法和臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范的貫徹實施，全國各地陸續(xù)規(guī)范地開展熒光定量PCR檢測技術，與常規(guī)PCR技術相比，實時熒光定量PCR具有特異性強，能有效解決PCR產(chǎn)物污染問題、自動化程度高等特點1,2。但由于熒光定量檢測試劑盒效期較短，連續(xù)檢測20次后做質(zhì)控圖時間較長，如果采用即刻法和質(zhì)控圖法相結(jié)合對HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控進行控制，并利用EXCEL表格繪制動態(tài)質(zhì)控圖，能對室內(nèi)質(zhì)控

4、管理體系起到良好的監(jiān)控作用。 1  材料和方法 11  材料  質(zhì)控血清來自北京天壇醫(yī)院肝病門診肝炎患者血清，經(jīng)乙肝五項檢測結(jié)果為HBsAg+、HBeAg+、抗HBcAb+的血清樣本10例，充分混勻；經(jīng)乙肝五項、丙肝、HIV檢測全陰性的血清樣本10例，充分混勻。以上兩組血清樣本均無黃疸、無脂血、無溶血現(xiàn)象，將其進行56 30min滅活，并將以上兩混合樣本以適當比例混合，使其檢測預期濃度在105106IU/ml之間。將質(zhì)控品充分混勻，保證其均一性。取高壓滅菌的0.5ml離心管數(shù)只，將上述質(zhì)控品每管110l分裝至離心管中，瞬時離心數(shù)秒，蓋蓋，用封口膜將其封口后直立放入

5、-70冰箱冷凍保存。使用時取出后室溫融解，震蕩混勻，瞬時離心數(shù)秒后使用;試劑使用上海復星公司HBV-DNA熒光定量PCR檢測試劑盒;羅氏lightcycler實時熒光定量PCR儀，高速低溫離心機，恒溫金屬浴，微量移液器等。 1.2  方法  取10只陽性質(zhì)控血清，在同一實驗室，同一操作人員使用同一臺儀器、同批號試劑進行操作，對制備的質(zhì)控品的均一性進行檢測。每次臨床檢測均設空白對照1份、陰性對照1份、陽性質(zhì)控品1份、標準品4份（濃度分別為7.5×107IU/ml、7.5×106IU/ml、7.5×105IU/ml、7.5×104IU/m

6、l），連續(xù)檢測3次后即可對第3次檢測結(jié)果進行質(zhì)控；連續(xù)檢測20次后即可繪制質(zhì)控圖，對20次以后的檢測結(jié)果進行質(zhì)控。 1.21  “即刻法”質(zhì)控方法  將連續(xù)的質(zhì)控測定值按從小到大的順序排列，即X1、X2、X3、X4Xn（X1為最小值，Xn為最大值）。計算均值（x）和標準差（SD）;按公式SI上限值=X最大值-XSD計算SI上限值和SI下限值：SI下限值=X-X最小值SD將SI上限值和SI下限值與SI值表（表1）中的數(shù)值比較。 122  質(zhì)控結(jié)果的判斷  SI上限值和SI下限值均小于表1中N2S對應的值時，說明測定質(zhì)控值的變化在兩個標準差之內(nèi)，是可以接受的

7、。如SI上限值和SI下限值中之一處于N2S和N3S對應的值之間時，說明該質(zhì)控測定值的變化在兩個標準差和三個標準差之間，處于“警告”狀態(tài)。當SI上限值和SI下限值之一大于N3S對應的值時，說明該質(zhì)控測定值的變化已超過三個標準差，屬“失控”狀態(tài)。 表1  “即刻法”質(zhì)控SI值表（略） 1.23  質(zhì)控圖法質(zhì)控方法  將20次質(zhì)控結(jié)果輸入EXCEL表格，并利用電腦計算出均值X±2S及X±3S，并以X±2S為警告線，X±3S為失控線，繪制質(zhì)控圖。將20次質(zhì)控樣本的結(jié)果取對數(shù)值，輸入B4到B23，將X-2S、X+2S、X、X-3S、X

8、+3S的數(shù)值輸入C4-G4和C23-G23，用鼠標從B4拖到G23，按工具欄中的“圖表向?qū)А秉c擊“折線圖”，按“完成”可得到質(zhì)控圖的基本輪廓，去除掉數(shù)值軸網(wǎng)絡線。以X±3S為失控線，以X±2S為警告線。將鼠標移至X+3S上兩個失控點中的任意一個點，右擊后選擇“添加趨勢線”，選擇“線性L”，按“確定”鍵，兩端點連成直線，即成失控線。用相同的方法繪制出警告線和均值線。 2  結(jié)果 2.1  準確性評價  每批次實驗同時做空白對照一份，陽性對照和陰性對照各一份，HBV-DNA陽性質(zhì)控品1份，標準品4份，分別為7.5×107IU/ml、7.5

9、×106IU/ml、7.5×105IU/ml、7.5×104IU/ml。實驗結(jié)果均顯示，空白對照和陰性對照為陰性結(jié)果，陽性對照為陽性結(jié)果，陽性質(zhì)控品為陽性結(jié)果，標準品呈線性關系，r值=-1.00，Error=0.0232。表明每次實驗均在控制之中，而且每次實驗的準確性均有保證，試驗結(jié)果可信。參見圖12。 圖1  HBV-DNA標準品7.5×107104IU/ml擴增曲線（略） 圖2  擬合標準曲線，Slope=-3.524，Intercept=47.7，Error=0.0232，r=-1.00（略） 2.2  質(zhì)控品均一性評

10、價  一次性檢測10份陽性質(zhì)控血清，病毒載量對數(shù)值的均值為5.54，標準差為0.08，CV為1.5%。質(zhì)控品均一性較好（圖3）。 圖3  10份HBV-DNA質(zhì)控品均一性檢測擴增曲圖（略） 2.3  將第120次質(zhì)控結(jié)果記錄于即刻法質(zhì)控表中（表2），計算SI上限值和SI下限值，通過查表1可得該20次質(zhì)控結(jié)果均小于N2S數(shù)值，在控制范圍內(nèi)。 2.4  經(jīng)過培訓的普通操作人員在儀器、試劑、設備及環(huán)境常規(guī)的狀態(tài)下進行連續(xù)20次檢測，得出常規(guī)條件下的變異（RCV）結(jié)果，病毒載量對數(shù)值的均值為5.54，標準差為0.22，CV為3.9%。 2.5  應用E

11、XCEL表格繪制出Levey-Jennings質(zhì)控圖，依據(jù)20次質(zhì)控結(jié)果計算出X和SD確定質(zhì)控限，依據(jù)其原則定X±2SD為警告限，X±3SD為失控限（圖4），并用黃色表示警告限，紅色表示失控限。將每批次實驗所做質(zhì)控結(jié)果取對數(shù)值后直接輸入相應EXCEL單元格中，圖表將自動顯示本次實驗質(zhì)控結(jié)果在質(zhì)控圖中的位置，檢測每次實驗質(zhì)控結(jié)果情況及質(zhì)控趨勢。 3  討論    在全面質(zhì)量管理體系中，實驗室內(nèi)質(zhì)量控制是一個重要的環(huán)節(jié)3?！凹纯谭ā辟|(zhì)控實際上是數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法中應用Grubbs剔除異常值的方法在免疫質(zhì)控中的應用4，該法只需要連續(xù)測定3次，即可對3次

12、結(jié)果中異常值進行檢驗，比較簡單，因此在臨床檢驗方面應用較廣，尤其是在免疫檢驗室內(nèi)質(zhì)控，如HBsAg檢測，抗-HIV檢測，抗-HCV檢測，抗梅毒抗體檢測5,6等，同時在血細胞檢測方面也有相關報道7。我們把“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控應用于臨床基因檢測實驗室中，優(yōu)點更為突出。     表2  20次熒光定量PCR方法檢測HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)結(jié)果（略） 圖4  HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控圖（略）    雖然近年來，隨著臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法和臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范的貫徹實施，以及衛(wèi)生部臨床檢驗中心對全國各地部

13、分臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收工作的陸續(xù)展開，許多地區(qū)臨床基因檢驗實驗室已開展臨床基因檢測工作，但是一些實驗室在質(zhì)量控制尤其是室內(nèi)質(zhì)控方面仍存在很大問題8，“即刻法”質(zhì)控能很好的克服傳統(tǒng)單一應用質(zhì)控圖法必須連續(xù)檢測質(zhì)控血清20次后才能進入質(zhì)控的缺陷，在測定3次后即可進入質(zhì)控狀態(tài)，監(jiān)測實驗結(jié)果的可靠程度，為樣本量較少、實驗周期長的實驗室提供了良好的質(zhì)量保證。雖然“即刻法”可以解決室內(nèi)質(zhì)控的一些問題，但它仍然存在一些問題9， “即刻法”前3次結(jié)果對后續(xù)質(zhì)控結(jié)果影響較大；當前3次結(jié)果精確度很好時，對后續(xù)質(zhì)控結(jié)果的精確度要求亦較高，否則容易出現(xiàn)失控，且多為假失控；當前3次結(jié)果不穩(wěn)定，s較大時，對后續(xù)

14、質(zhì)控結(jié)果影響更大，后續(xù)結(jié)果中會出現(xiàn)較多的假在控和假失控?！凹纯谭ā蓖瑯硬荒芘袛噙B續(xù)趨勢性上升或下降失控，對試劑的靈敏度也不能進行監(jiān)控。     質(zhì)控圖能直觀的監(jiān)測質(zhì)控結(jié)果及其變化趨勢，但質(zhì)控圖本身只是一種工具，因此也有個質(zhì)量問題，即它具備什么條件才能真正起到過程控制作用10。當一個質(zhì)控圖繪制成功，就必須進行分析繪制質(zhì)控圖的過程是否在“控制”條件下進行，此時的質(zhì)控圖實質(zhì)上是“分析用質(zhì)控圖”。本室質(zhì)控圖繪制后，CV為3.9%，小于臨床允許誤差；20次質(zhì)控值均在X±2SD范圍內(nèi)，并符合Westgard質(zhì)控規(guī)則的13S、22S和41S，此質(zhì)控圖可以用做 “管理用

15、質(zhì)控圖”，控制檢驗過程。同時此質(zhì)控圖繪制出了警告線和失控線，給判斷檢測結(jié)果數(shù)值是否在控制限內(nèi)提供了方便，大大提高了工作效率，非常有利于臨床推廣應用。     所以“即刻法”雖然能解決質(zhì)控中的一些問題，但還應結(jié)合L-J質(zhì)控圖法相結(jié)合對HBV-DNA的熒光定量檢測進行室內(nèi)質(zhì)量控制，這樣綜合兩種方法的優(yōu)點，對于應用熒光定量PCR的方法進行HBV-DNA檢測的室內(nèi)控制不失為一種切實可行的方法。 【參考文獻】   1 Jardi R, Rodriguez F, Buti M, et al. Quantitative detection of hepatitis B

16、 virus DNA in serum by a new rapid real-time fluorescence PCR assayJ. J Viral Hepat, 2001, 8:465471.    2 Ho SK, Yam WC, Leung EK, et al. Raped quantification of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using fluorescent hybridization probesJ. J Med Microbiol, 2003,52:397402. 

17、   3 王治國,李小鵬,武平原. 臨床檢驗定量測定室內(nèi)質(zhì)控系統(tǒng)的建立J.檢驗醫(yī)學，2004，19：69.    4 秦曉光.適用于免疫測定的“即刻法”質(zhì)控方法-Grubbs氏異常值取舍法J.中華醫(yī)學檢驗雜志，1992，15：37.    5 張惠榮,耿海杰. ELISA檢測HIV抗體“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控J. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005,15(4)：491.    6 徐慶華，殷仰周，董麗丹. 抗-HCV試劑的“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控J.中國輸血雜志，2001，14（2）：85.    7 李素敏,韓俊虎.用血細胞計數(shù)儀對成分血進行“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控