產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)時熒光PCR方法的建立

1、 石玉玲等:產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)時熒光PCR方法的建立391圖l產(chǎn)氣莢膜梭菌熒光定PER檢測敏感性的擴(kuò)增結(jié)果2.4熒光定量PCR檢測產(chǎn)氣莢膜梭茵的特異性對創(chuàng)傷弧菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、產(chǎn)吲哚黃桿菌、ATCC25923金黃色葡萄球菌、ATCC27853銅綠假單胞菌、ATCC25922大腸埃希菌、ATCC35656多食鞘氨醇桿菌、ATCC43047陰溝腸桿菌、ATCCl2453奇異變形桿菌、ATCC35157肺炎克雷伯菌、ATCCl4028傷寒沙門菌、ATCC51331嗜麥芽窄食單胞菌分別提取核酸,用本研究建立的方法進(jìn)行檢測。除產(chǎn)氣莢膜梭菌出現(xiàn)很好的陽性結(jié)果外,其他細(xì)菌檢測結(jié)果均呈陰性。說明我們建立的熒光

2、定量PER檢測方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌有較好的特異性,與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)。2.5臨床樣本中產(chǎn)氣莢膜梭茵的檢測病例A:患者,男性,26歲。于2010-0204因汽車壓傷致左踝、足裂傷流血、畸形2h入本院。左踝和足內(nèi)側(cè)的皮膚、骨、足拇長伸肌腱、足背動脈缺如,骨、肌肉外露,創(chuàng)面臟污。各足趾末梢血運(yùn)較差,第1趾感覺麻木、發(fā)白。足底皮膚完全剝脫。X線片示左踝關(guān)節(jié)骨折并脫位,左足多發(fā)骨折并部分骨缺損,軟組織高度腫脹,取分泌物進(jìn)行檢測。病例B:患者,男性,81歲,于20100327因“右下肢髂窩膿腫,手術(shù)后形成漏口”入南方醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,取穿刺液進(jìn)行檢測。病例C:患者,男性,44歲,有糖尿病病史,于2009-

3、09-16因“右下肢進(jìn)展性紅腫、潰瘍、流膿、壞死伴疼痛1月”人本院,取分泌物進(jìn)行檢測。采用本方法,能準(zhǔn)確檢測到臨床樣本中產(chǎn)氣莢膜梭菌的存在,陰性對照無熒光存在,整個檢測過程34h完成,大大縮短了檢測時間,為產(chǎn)氣莢膜梭菌的臨床診斷提供了一種快速可靠的診斷方法。3討論產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭陽性粗大梭菌,大小為(3-4×(11.5lxm,單獨(dú)或成雙排列,有時也可成短鏈排列;芽胞呈卵圓形,芽胞寬度不比菌體大,位于中央或末次端;在膿汁、壞死組織或感染動物臟器的涂片上,可見有明顯的莢膜,無鞭毛,不能運(yùn)動。根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)生外毒素的種類差別,可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分成a,b、e、d、e等5型。對人致病的主要是a型

4、,引起氣性壞疽和食物中毒,c型則引起壞死性腸炎。產(chǎn)氣莢膜梭菌是氣性壞疽的主要病原菌。氣性壞疽是戰(zhàn)時多見的一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷感染,以局部水腫、產(chǎn)氣、肌肉壞死及全身中毒為特征,病亡率高達(dá) 圈2佐床標(biāo)本中產(chǎn)氣莢膜梭菌DNA的擴(kuò)增曲線LETTE I H.,l圈3病例A、B厭氧血平板培養(yǎng)結(jié)果40%一100%。在戰(zhàn)爭狀態(tài)下,由于疫原通常是多樣性的和未知的,一旦發(fā)生氣性壞疽,樣品的檢測量大、生物安全性要求高,重要的是危害性評估要求定量準(zhǔn)確。然而,目前國內(nèi)外均未見對產(chǎn)氣夾膜梭菌引起的人體氣性壞疽檢測方法的報道,因此有必要建立一種快速測定產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法,以滿足日常和戰(zhàn)時需要。近年來的文獻(xiàn)資料顯示,實(shí)時熒光定量P

5、CR技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),已廣泛用于基因表達(dá)病原體檢測等諸多研究領(lǐng)域【卅。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在普通PCR的基礎(chǔ)上又高了一個新的水平,無論敏感性、特異性與速度都具有優(yōu)勢。但它對引物和探針也提出了更高的要求151,因?yàn)橐锱c探針的設(shè)計直接影響方法的特異性和靈敏度。為了保證方法的特異性,我們選取產(chǎn)氣莢膜梭菌高度保守的16S rRNA基因,相對于其他物種具有高度特異性。經(jīng)過大量比對、篩選,最終確定一對引物,并在該引物的擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計一條特異性熒光探針。為了保證方法的靈敏度和擴(kuò)增效率,獲得檢測最低Ct 值和最高熒光強(qiáng)度值(ARn,同時對所建立的實(shí)時熒光PCR方法進(jìn)行了引物、探針濃度優(yōu)化,確

6、定了反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)。經(jīng)過對創(chuàng)傷弧菌等12種相關(guān)細(xì)菌菌株的檢測,發(fā)現(xiàn)不僅特異性高,而且比傳統(tǒng)培養(yǎng)法更敏感、快速,也更簡便。用本方法從核酸提取至完成檢測,最快能在3h內(nèi)完成,對純菌檢測的靈敏度低于10CFU/反應(yīng)體系,一次檢測量可以達(dá)到96或384個樣本,而且該方法實(shí)行完全閉管式操作,從根本上杜絕了常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染和假陽性的問題。對臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果顯示,病例A、B患者產(chǎn)氣莢膜梭菌熒光定量PCR檢測陽性,3d后細(xì)菌厭氧培養(yǎng)分離到產(chǎn)氣莢膜梭菌,說明該方法可早期、快速診斷產(chǎn)氣莢膜梭菌感染,為臨床治療提供有力依據(jù)。病例C患者傷口分泌物涂片可見大量革蘭陽性菌,從臨床癥狀分析,多數(shù)醫(yī)生考慮氣性壞疽,而熒光定量PCR方法檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌陰性,細(xì)菌厭氧培養(yǎng)分離到多毛擬桿菌、消化鏈球菌,未見產(chǎn)氣莢膜梭菌。提示多種細(xì)菌感染特別是混合厭氧菌感染時可同樣表現(xiàn)出皮下腫脹、腥臭味和捻發(fā)音,而顯微鏡下難以鑒別。因而在臨床懷疑氣性壞疽時,應(yīng)行熒光定量PCR快速檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌,避免因誤診導(dǎo)致患者截肢。我們針對產(chǎn)氣莢膜梭菌,成功