人肝癌組織中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶異常表達及其基因甲基化程度的研究

1、人肝癌組織中-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶異常表達及其基因甲基化程度的研究【摘要】目的探討-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)基因在人類肝癌發(fā)生過程中的表達及改變機制。方法以病理組織學、生物化學和分子生物學方法，將自身配對的肝癌、癌旁組織和遠癌組織中總RNA純化，對GGT的表達與改變進行了分析；并設(shè)計兩套引物，以逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR法擴增GGT5-非編碼區(qū)(NC)基因和限制性內(nèi)切酶消化分析了不同肝癌組織中GGT基因的甲基化程度。結(jié)果在病理組織學證實的24例肝癌、癌旁和遠癌組織中：從肝癌灶至遠癌的不同組織中，總RNA濃度呈逐步升高趨勢，三種不同組織間的差異均有顯著性(P0.05);癌組織中總GGT比活性(U/g)較癌周和遠癌組

2、織明顯升高(P0.05);以自行設(shè)計建立的逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR法，成功地擴增GGT的5-NC基因片段，特異性強且區(qū)帶清晰，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切分析證明，GGT基因5-NC M3位點(CCGG)，其內(nèi)位C在癌灶、癌周和遠癌組織中的低甲基化頻率分別為70.83%,58.33%和54.17%，非常明顯地高于同組中已甲基化程度。結(jié)論肝癌組織中GGT基因甲基化程度較低，且與肝癌GGT的異常表達關(guān)系密切，對肝細胞癌變可能起促進作用?！娟P(guān)鍵詞】肝癌-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶基因表達RNA甲基化 Abnormal expression and methylation status of -glutamyl transferase

3、 (GGT) genes in human hepatoma tissueTANG Qiyun, YAO Dengfu, LIU Yanhua, et al. The First Hospital, Yancheng City of Jiangsu Prouince, 224001【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanisms of expression and alteration of -glutamyl transferase (GGT) genes during the development of human hepatic carcinom

4、a.MethodsThe total RNA concentration and the expressions and changs of different molecular forms of GGT in the self-controled liver cancerous, paracancerous and distal cancerous tissues were investigated by pathologic examination, biochemical and molecular biological assays. Moreover, the part GGT g

5、enes of the 5-NC region were amplified with two sets of primers by using a nest RT-PCR assay, and methylation status of GGT genes were also studied by a restriction endonuclease RT-PCR technique.ResultsOf the 24 tissue specimens confirmed by pathological examination: An increasing tendency of total

6、RNA concentrations was found from cancer to distal cancerous tissues, and there was a marked difference (P0.05) between those in liver cancers and paracancerous /or distal cancerous tissues; The specific activities (U/g) of total GGT was significantly higher (P0.05) in hepatoma tissues than in those

7、 of paracancerous/or distal cancerous tissues; Analysed by using a restriction endonuclease RT-PCR assay, the inner C of M3-CCGG-site of GGT 5-NC genes in their PCR products showed universal hypomethylation. The frequency of hypomethylated M3 site was 70.83% in hepatomas, 58.33% in paracancerous and

8、 54.17% in distal cancerous tissues and was significantly higher than that of the M3 site methylated cases in the same group.ConclusionsThe hypomethylation status of GGT genes in hepatomas is strongly correlated with the abnormal expression of hepatoma GGT and hypomethylated GGT gene might promote t

9、he liver canceration during hepatocarcinogenesis.【Key words】Hepatoma-GGTGeneExpressionRNAMethylation體內(nèi)-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)既與生物轉(zhuǎn)化、核酸代謝及腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，又是反映肝細胞惡性病變的靈敏標志酶1，2。GGT在胚胎期以肝內(nèi)最多，出生后逐步降至較低水平；當肝細胞發(fā)生癌變時，肝內(nèi)GGT重新大量表達，并且出現(xiàn)較明顯的異質(zhì)性改變。已知肝細胞癌變過程中，總基因組DNA甲基化水平、部分癌基因及癌相關(guān)基因如c-fos等呈低甲基化狀態(tài)，DNA胞嘧啶殘基的甲基化，特別是CCGG序列內(nèi)位C甲基化狀態(tài)與基

10、因的調(diào)控和表達有密切關(guān)系3，4，但GGT基因甲基化狀態(tài)與肝癌發(fā)生之間有何關(guān)系尚不清楚。本研究通過分析人肝癌組織中總RNA濃度、酶蛋白表達和對GGT基因進行擴增觀察其甲基化程度，試從分子水平來探討細胞癌變機制。材料與方法一、研究對象收集1997年7月1998年4月外科手術(shù)新鮮肝組織標本，標本來自南通醫(yī)學院附屬醫(yī)院及江蘇省鹽城市第一、第二人民醫(yī)院，分別留取肝癌組織、癌周組織及遠癌組織各24份，各約200mg，取部分肝組織作病理學檢查(H.E染色)，其余置于85C冰箱保存，留作提取總RNA、GGT非編碼區(qū)基因擴增以及GGT酶蛋白的制備。二、肝GGT酶蛋白提取與濃度分析稱取肝癌組織、癌旁和遠癌組織濕重

11、50mg，以含0.5%Triton X-100的勻漿液置冰水浴中，高速勻漿后置于4C過夜，在高速冷凍離心機上，以15 000r/分離心45分鐘，留上清液于20C備用。以-谷氨酰對硝基苯胺直接法，分析上清液中GGT活力(U/L)，并以福林-酚試劑法測其蛋白濃度(g/L)，并計算出酶比活性單位(U/g)。三、肝組織總RNA制備與濃度精確稱取肝組織50mg，置于無RNAase勻漿器中，加入RNAzole 1.0ml勻漿2分鐘，再按Okamoto等5方法提取總RNA，加入TE緩沖液100l，取部分RNA于UV-2201型紫外分光光度計上測A260，換算出總RNA濃度(g/mg組織)。經(jīng)紫外分光掃描鑒定

12、，純化的RNA未受到污染和降解。其余RNA置于85C保存?zhèn)溆?。四、引物設(shè)置及逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR擴增以肝癌細胞株GGT核苷酸序列5設(shè)計巢式PCR擴增引物(1)，由中科院上海細胞所合成。設(shè)計擴增序列位于GGT5-非編碼區(qū)，含有CCGG的M3位點(409bp處)。肝GGT-RNA先經(jīng)隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再以此為模板在PE480型DNA擴增儀上進行巢式PCR擴增，每次擴增35個循環(huán)。第一階段PCR以外部引物(GT-1,5-CTCCATTCGTAGACCACCTC-3;GT-2,5-TAGGTTAGACTGTGGGCAGG-3)和cDNA為模板，擴增產(chǎn)物為400bp；第二階段PCR，以擴增的P

13、CR產(chǎn)物為模板和內(nèi)部引物(GT-3，5-TGTCTGCCTCTGAGGTCAGA-3；GT-4，5-CAGGTCTCTTGCTCACTGTA-3)進行擴增，最終PCR產(chǎn)物280bp。作定性檢測并存于85C留作甲基化分析。1GGT部分基因及其擴增位置示意五、GGT M3位點甲基化程度分析將GGT-RNA逆轉(zhuǎn)錄合成GGT-cDNA，再按上述第一階段PCR步驟擴增，擴增結(jié)束后取產(chǎn)物5l，加入Hap10U與雙倍體積Hap緩沖液混勻，37C作用4小時，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，在透射紫外光照射下，與標準DNA比較判別GGT的M3位點是否已甲基化。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶消化后，若出現(xiàn)與原設(shè)計一致的322bp和78bp

14、片段，則表示GGT該段基因未甲基化；PCR產(chǎn)物經(jīng)酶消化后，被擴增的基因片段仍表現(xiàn)為400bp，說明限制性內(nèi)切酶Hap不能消化該位點，則表示GGT的基因已甲基化；PCR產(chǎn)物經(jīng)酶消化后無特異性DNA片段出現(xiàn)，則表示該段基因不能擴增。結(jié)果一、肝癌組織的病理學檢查手術(shù)后的新鮮肝組織作病理檢查，按自身對照原則分三組：(1) 癌組：包括20例原發(fā)性肝癌(PHC)，4例系轉(zhuǎn)移性肝癌(來自胃癌2例，胰腺癌1例，乳腺癌1例)；(2)癌旁組：組織學顯示肝硬化17例，慢性肝炎3例，伴不典型增生16例；(3) 遠癌組：肝硬化11例，慢性肝炎9例，伴不典型增生者11例；地衣紅染色示HBV陽性者19例。二、肝總RNA濃度

15、與GGT比活性變化不同肝組織中總RNA濃度和總GGT比活性(T)變化，見表1。組織中總RNA濃度，肝癌組織明顯較癌周和遠癌組織低(P0.05)，肝癌組織中總GGT比活性非常明顯地高于癌周和遠癌組織(P0.01)。表1肝組織總RNA及T-GGT比活性變化(s)組別例數(shù)總RNA(U/mg)肝勻漿T-GGT(U/g)肝癌2421.1130.84100.6087.43癌周2439.9831.45*51.6121.71*遠癌2453.8450.50*46.6116.42*與肝癌組織比較*P0.05*P0.05)，但各組內(nèi)未甲基化例與甲基化例的比較均差異有非常顯著性(P0.001)；各組中GGT基因未檢出

16、例，均系表1中RT-PCR未擴增出特異性陽性區(qū)帶的肝組織。表2RT-PCR擴增產(chǎn)物Hap酶切消化結(jié)果組織例數(shù)甲基化(%)未甲基化(%)未確定(%)肝癌246(25.00)17(70.83)*1(4.17)癌周247(29.17)14(58.33)*3(12.50)遠癌246(25.00)13(54.17)*5(20.83)與甲基化例比較：*P0.001,*P0.025,*P0.05 討論肝組織癌變時能合成和分泌多種與肝癌相關(guān)的蛋白質(zhì)、多肽或同工酶，如AFP和GGT-等1，2，為了解肝癌GGT的產(chǎn)生與機制，本文研究了24例人肝癌癌組織、癌旁組織、遠癌組織中GGT的表達與改變。經(jīng)病理學檢查，肝癌的

17、遠癌組織以肝細胞變性為主，癌周組織以肝硬化為主，大多數(shù)組織(19例)伴有乙肝病毒感染，符合人類肝癌的多階段過程。肝癌組織總GGT比活性高于癌周及遠癌組織(P0.05)，說明GGT在肝癌、癌周組織呈過量表達趨勢。癌周及遠癌組織GGT比活性比較差異無顯著性，系由于癌周和遠癌組織多伴不同程度的肝炎、肝硬化，只是病變程度不同而已，未形成癌的質(zhì)的變化。肝癌的發(fā)生與DNA合成及核酸代謝旺盛密切相關(guān)6，7，但本組病例肝組織總RNA濃度，在各組間的差異有顯著性(P0.05)，且與GGT活性增加呈相反的變化，可能與人肝癌發(fā)生經(jīng)過不同程度肝炎、肝硬化到肝癌長達數(shù)十年的發(fā)病過程，其中包括肝細胞壞死、結(jié)節(jié)樣增生、假小

18、葉形成、大量的纖維結(jié)締組織代替正常肝細胞使腫瘤組織殘存肝細胞減少，同時伴腫瘤組織出血、壞死，則表現(xiàn)為有形細胞成分減少，組織總RNA減少，其復雜機制有待進一步闡明。GGT基因5-NC區(qū)由744個核苷酸組成(含6個CCGG位點)，M3位點的甲基化狀態(tài)如何尚不清楚。通過該項研究，發(fā)現(xiàn)在M3位點存在廣泛的低甲基化，肝癌、癌周、遠癌組織低甲基化頻率分別為70.83%、58.33%和54.17%，組間差異無顯著性，似乎與GGT活性有同向變化關(guān)系，提示GGT基因低甲基化誘導GGT表達，導致肝組織和血中GGT活性升高。Suzuki等8認為，對LEC大鼠使用低甲基化5-雜氮胞嘧啶(5-aza)，使LEC大鼠5-

19、甲基胞嘧啶含量明顯的減少，同時鼠GGT大量表達，最終使該組大鼠發(fā)生肝腫瘤，而對照組未發(fā)生這種變化，說明肝細胞對低甲基化藥物高度敏感，且DNA甲基化 減少在其發(fā)展為肝炎或肝腫瘤中起一定的作用。Baik等9以5-aza作用于高度甲基化的Fao細胞，在引起脫甲基化作用的同時，出現(xiàn)GGT強烈而穩(wěn)定的表達，認為去甲基化增加GGT基因的表達。本組病例中，5例癌組織GGT基因M3位點發(fā)生甲基化，其中1例伴有癌旁組織M3位點甲基化，2例伴癌旁、遠癌組織該位點甲基化，另2例(胃癌肝轉(zhuǎn)移1例)均不伴有癌旁、遠癌組織該位點甲基化，提示肝癌時GGT基因甲基化類型存在著異質(zhì)性10。本研究僅為初步認識，但有關(guān)人類GGT基

20、因甲基化類型、GGT基因表達與GGT活性的關(guān)系，以及正常肝GGT的甲基化狀態(tài)等尚有待深入研究。國家教委留學回國人員課題(No.教外司留95)作者單位：224001江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院(湯琪云)；南通醫(yī)學院附屬醫(yī)院(姚登福、劉艷華、孟憲鏞、吳信華、吳瑋、陸建新)；鹽城市第二人民醫(yī)院(楊樹成)參考文獻1. 姚登福，孟憲鏞.肝癌特異性GGT診斷肝癌的研究進展.國外醫(yī)學內(nèi)科學分冊，1997，24：59-62.2. 姚登福，黃介飛，陳澍周，等.肝癌特異性GGT的發(fā)生及其定量分析的臨床價值.胃腸病學和肝臟病學雜志，1997，6：78-81.3. Choi EK, Uyeno S, Nishida N,

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