多孔羥基磷灰石納米球作為抗壞血酸載體的研究

1、多孔羥基磷灰石納米球作為抗壞血酸載體的研究    摘要利用超聲輔助的化學(xué)共沉淀法制備了羥基磷灰石納米材料,并實現(xiàn)了其對抗壞血酸的包載.采用透射電鏡、氮氣吸附孔徑分析儀、X射線粉末衍射儀、傅里葉紅外光譜儀和紫外分光光度計等對所得納米材料的微觀形貌、孔徑分布、物相、表面官能團(tuán)和負(fù)載抗壞血酸量進(jìn)行了表征和分析,并在超聲輔助條件下進(jìn)行了藥物釋放動力學(xué)研究.結(jié)果表明,在抗壞血酸存在的條件下,利用聲化學(xué)方法可以制得多孔的羥基磷灰石納米球,其平均直徑約為140 nm,平均孔直徑約為15 nm,可實現(xiàn)對抗壞血酸的包載.此外,在超聲輔助的條件下,該納米球具有持續(xù)釋藥的能力

2、,不同的超聲功率能改變載藥粒的釋藥速度,表明這種多孔羥基磷灰石納米球是一種具有很大應(yīng)用前景的骨組織藥物載體.關(guān)鍵詞藥物載體;羥基磷灰石;抗壞血酸;控釋抗壞血酸(Ascorbic acid, AA)是一種水溶性維生素,在生物學(xué)、藥劑學(xué)和皮膚病學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義.例如,作為抗氧化劑,它能消除促進(jìn)皮膚老化的氧化劑和自由基1;刺激膠原蛋白的合成,減少DNA被氧化損壞和促進(jìn)DNA修復(fù),具有抗癌作用2;因其可抑制黑色素沉淀和分解黑色素,所以可作為增白劑.但抗壞血酸對氣氛、水分、光、熱和氧氣等非常敏感,使其臨床應(yīng)用受到了很多限制.國際上正在嘗試使用丙烯酸樹脂微球3及氧化鋅顆粒1等有機(jī)和無機(jī)材料作為其載體,

3、以達(dá)到對其保護(hù)與緩釋的目的.羥基磷灰石(Hydroxyapatite, HAP)是人體硬組織的一種成分,具有良好的生物相容性、骨引導(dǎo)性和生物活性4. HAP作為藥物載體的研究近幾年已成為國內(nèi)外研究的熱點,利用不同方法將其單獨或與其它材料復(fù)合制成多孔性材料,作為干擾素5、布洛芬6、亞甲基藍(lán)7、骨形成蛋白8和血清蛋白9等的載體,達(dá)到了對被包載材料的保護(hù)和緩釋目的.本實驗采用超聲空化10的方法制備了多孔HAP納米球,初步研究了這種材料對抗壞血酸的包載能力和控釋能力,為其臨床應(yīng)用提供了方法和依據(jù).1實驗部分1.1試劑與儀器抗壞血酸(AA)購于Sigma-Aldrich公司;合成HAP納米球所用試劑Na

4、2HPO4·12H2O, CaCl2及配制模擬體液(Simulate body fluid, SBF)所用試劑NaC,l NaHCO3, KC,l K2HPO4·3H2O, MgCl2·6H2O,HC,l Na2SO4和Tris等均為分析純,購于杭州匯普化工儀器有限公司.JEM-1230型透射電鏡(日本JEOL公司); DU530紫外分光光度計(美國Beckman公司); Sigma3-18K臺式冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司); F-Sorb 3400比表面積及孔徑分析儀(北京金埃譜科技有限公司); Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀(美國Thermo El

5、ectron公司); ARL XTRA X射線粉末衍射儀1.2實驗過程實驗在常溫常壓避光環(huán)境中進(jìn)行.首先,將50L濃度為0·1 mol/L的AA溶液加入到盛有45 mLCaCl2溶液(0·0056mol/L)的錐形瓶中,磁力攪拌30min后,用1mol/LNH3·H2O調(diào)節(jié)溶液pH=9·5,繼續(xù)攪拌2 min;在100 W超聲條件下,于2 min內(nèi)向錐形瓶中滴入5 mL濃度為0·03 mol/L的Na2HPO4溶液,繼續(xù)攪拌2min,得到白色懸濁液.將該懸濁液在8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心8min,取沉淀物冷凍干燥即得載藥樣品.上述合成反應(yīng)中

6、不加入AA,其它步驟不變可得空白樣品.實驗結(jié)果表明1, AA長期處于堿性溶液環(huán)境中會使其含量逐漸下降,而本實驗的合成反應(yīng)僅用4 min,反應(yīng)結(jié)束時溶液呈中性,中性條件對AA的影響不大.若按AA處于pH=9·5的堿性溶液5 min后含量下降0·51%計,實驗條件下短暫的堿性環(huán)境對AA的影響可以忽略.樣品的釋藥動力學(xué)研究在模擬體液(SBF)中進(jìn)行.參照文獻(xiàn)11方法配制SBF溶液,每次取載藥樣品0·06 g分散于15mL SBF中,保持體系溫度不高于25,分別在75, 105和150W的功率條件下超聲處理懸濁液3 min,然后將懸濁液在8000 r/min下離心8 mi

7、n,取全部上清液,并經(jīng)0·22m孔徑的濾膜過濾后,用紫外分光光度計測量溶液的吸光度(max=265 nm),對照AA的紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到其釋藥量.向上述離心得到的沉淀中加入新鮮SBF溶液15 mL,間隔20 min,沿用上述方法再次超聲處理,測其離心后上清液中的藥物含量,如此反復(fù)測得不同時間的累積釋藥量.2結(jié)果與討論2.1載藥納米顆粒形貌與結(jié)構(gòu)圖1(A)為載藥納米顆粒的TEM照片,顆粒呈較均勻的球形,直徑約為150 nm,并且球體內(nèi)部呈現(xiàn)不同的襯度,說明其為多孔結(jié)構(gòu).圖1(B)為合成反應(yīng)中不含有AA而獲得的顆粒的TEM照片,顆粒形貌不如前者規(guī)則,少數(shù)顆粒內(nèi)部也呈現(xiàn)不同襯度,多集中

8、在顆粒中間,與前者不同.對2m×2m面積范圍內(nèi)的375個載藥顆粒的直徑進(jìn)行統(tǒng)計分析,得到其尺寸分布如圖1(C)所示,顆粒粒徑分布在50300 nm的范圍內(nèi),平均粒徑為142 nm.載藥顆粒和空白顆粒的孔徑大小及分布如圖1(D)所示,測試前,載藥顆粒經(jīng)過熱處理,以盡可能多地除去顆粒中載有的AA.由于聲化學(xué)的作用,兩種顆粒都有孔結(jié)構(gòu)形成,而且兩者的孔徑主要分布在1040 nm范圍內(nèi),空白顆粒的微孔較多,載藥顆粒具有較發(fā)達(dá)的中孔(250 nm)和大孔.因此,空白顆粒的BET比表面積(89·82 m2/g)較載藥顆粒的BET比表面積(83·35 m2/g)大,而由于AA的

9、存在起到了表面活性劑的作用,使得載藥顆粒的平均孔直徑(15·35 nm)比空白顆粒的平均孔直徑(12·90 nm)大,其結(jié)果與TEM分析較吻合.材料的多孔結(jié)構(gòu)使其較適宜用作藥物載體.利用XRD和FTIR對所得載藥顆粒的成分、結(jié)晶度和表面官能團(tuán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析.載藥顆粒和空白顆粒的XRD譜圖圖2(A)顯示,譜圖上的2個主要衍射峰(2=25·9°, 31·8°)分別對應(yīng)于HAP標(biāo)準(zhǔn)卡(JCPDS09-432)的(002)和(211)晶面,表明所得載藥顆粒和空白顆粒的無機(jī)相為HAP.與HAP標(biāo)準(zhǔn)卡相比,顆粒的衍射峰較少,而且明顯寬化,說明得到

10、的顆粒結(jié)晶度較差.對實驗中所用的AA白色粉末進(jìn)行了物相分析,所得XRD結(jié)果與AA的標(biāo)準(zhǔn)卡(JCPDS22-1560)高度一致,證明其為高純度的AA結(jié)晶粉末.但在載藥顆粒的XRD衍射曲線上沒有明顯的AA衍射峰出現(xiàn),這主要是由于在本實驗條件下, AA在顆粒中所占質(zhì)量的理論值不足2%, AA含量較少的原因.圖2(B)為顆粒和純AA的FTIR譜圖.在載藥HAP顆粒和空白顆粒的譜圖中,位于571, 601和1048 cm-1處的吸收峰對應(yīng)于HAP中的PO3-4的振動吸收, 3435和664 cm-1處的峰為OH振動所致的吸收峰;在載藥HAP顆粒的FTIR譜圖中也未發(fā)現(xiàn)AA官能團(tuán)的存在,其原因同樣是由于A

11、A負(fù)載量較少的緣故.已有研究表明,聲化學(xué)有助于形成空心或多孔納米球材料,如Dhas12和Wang等13應(yīng)用聲化學(xué)方法分別制備了空心MoO3納米球和空心PbS納米球,其最終得到的納米顆粒形貌與所選擇使用的表面活性劑的性質(zhì)有關(guān).本研究的實驗結(jié)果也表明,利用聲化學(xué)方法可以簡單快捷地合成出多孔納米HAP球狀顆粒.在合成過程中, AA既是需負(fù)載的藥物,也起到了表面活性劑的作用.當(dāng)溶液pH>4·17時,溶液中的AA(pK1=4·17)會形成帶負(fù)電的AA陰離子1,當(dāng)它被加入到富含鈣離子的溶液中時,會因靜電作用首先與鈣離子結(jié)合,隨后鈣離子在堿性條件下與加入的PO3-4形成HAP沉淀,

12、并將AA包載于其中.同時,由于HAP強(qiáng)烈的吸附作用,溶液中剩余的AA也會被吸附在HAP納米球表面,增加了顆粒負(fù)載AA的量.2.2載藥納米顆粒的釋藥性能顆粒對于AA的負(fù)載量可用紫外分光光度計進(jìn)行檢測14.含藥SBF溶液的典型紫外吸收光譜圖如圖3(A)所示.由圖3(A)可知, AA在波長為265 nm處有最大吸收,故在max=265 nm處繪制了AA的紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3(B),校正的模擬函數(shù)如下:c=7×10-5×A式中,c表示AA的濃度(單位mol/L); A表示AA的吸光度(Absorbance).相關(guān)度0·9998.首先對載藥顆粒的載藥率進(jìn)行了分析.采用紫外分

13、光光度計分別檢測了反應(yīng)前后溶液中AA的含量,再根據(jù)載藥率(R)公式計算15:R=(X-Y) /Y×100%式中,X表示載藥前溶液濃度,Y表示載藥后溶液濃度(單位mol/L).由計算可知,所制得多孔納米HAP顆粒對AA的負(fù)載量為(59·9±5·34)%,表明該顆粒的確具有一定的藥物負(fù)載性能.在不同超聲輔助條件下對載藥顆粒的藥物釋放動力學(xué)進(jìn)行了初步研究.由圖4可知,當(dāng)超聲功率為75W時,藥物釋放速度約為0·82g/min,約300 min后,藥物釋放速度達(dá)到一個穩(wěn)定值,約為0·4Fig. 4Cumulative curves ofAA r

14、eleased fromAA-loaded nanoparticles under differentultrasonic powersa. 75W;b.105W;c.150W.g/min;當(dāng)超聲功率增加至105W時,藥物釋放速度增大到1·09g/min;當(dāng)超聲功率為150 W時,其藥物釋放速度達(dá)到了1·5g/min,且在150 min時就達(dá)到了穩(wěn)定值.由此表明,由于在HAP顆粒上的負(fù)載而實現(xiàn)了AA在溶液體系中的釋放;利用超聲處理可在一定程度上改變藥物的釋放速度,其藥物釋放速度與超聲功率成正比,即隨著超聲功率的增強(qiáng), AA的釋放速度加快.但3種條件下顆粒的釋藥總量均未達(dá)到總

15、載藥量的60%,這可能是由于釋藥過程在常溫常壓恒氧的環(huán)境中進(jìn)行,對載藥粒中AA的穩(wěn)定性產(chǎn)生了影響,部分AA被氧化所導(dǎo)致.超聲輔助藥物釋放在目前的醫(yī)療行業(yè)已被廣泛應(yīng)用,它能增加藥物在特定部位的釋放量,有一定的靶向作用,減少了藥物浪費和藥物對其它組織器官的毒副作用.而且一定功率的超聲處理對人體正常組織沒有損傷.本研究的載藥顆粒在超聲輔助作用下有持續(xù)釋放藥物的特點,說明AA并不是單純地被吸附在顆粒表面(這會導(dǎo)致顆粒的釋放速度無法持續(xù)),顆粒也不存在較大的中空結(jié)構(gòu)(這將導(dǎo)致藥物釋放速度的突然增大),而是AA被較均勻地包載在球體的多孔結(jié)構(gòu)中,由于超聲對多孔結(jié)構(gòu)的逐步破壞從而導(dǎo)致藥物的可控釋放.綜上所述,

16、本研究利用聲化學(xué)方法制備了具有負(fù)載AA能力的多孔HAP納米球,采用超聲輔助的方法,可以實現(xiàn)AA在模擬體液中的可控釋放,其釋放速度可以通過改變超聲功率的方法加以控制.納米材料作為藥物載體,因其可被輸送到生物體微小組織器官而有望實現(xiàn)藥物的最佳療效.本方法簡單易行,得到的多孔納米球在骨修復(fù)的藥物傳遞和腫瘤治療等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值.參考文獻(xiàn) 1 DesalK. G. H., Liu C., ParkH. J. J. MicroencapsulationJ, 2005,22(4): 363376 2 HalliwellB. Mutation ResearchJ, 2001,475: 2935 3 E

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