保健食品中9種脂溶性維生素的測定

1、附件5保健食品中9種脂溶性維生素的測定BJS 20仃仃1范圍本方法規(guī)定了營養(yǎng)素補(bǔ)充劑類保健食品中維生素A、維生素A醋酸酯、維生素 D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素 &、維生素K2、3胡蘿卜素含量的液相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本方法適用于營養(yǎng)素補(bǔ)充劑類保健食品中維生素A、維生素A醋酸酯、維生素 D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素 Ki、維生素K2、3-胡蘿卜素含量的測定。2原理試樣經(jīng)混合溶液（異丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80, v:v:v）提取后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，外標(biāo)法定量。3試劑和材料除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為

2、GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。3.1試劑3.1.1甲醇：質(zhì)譜級(jí)。3.1.2乙腈：質(zhì)譜級(jí)。3.1.3異丙醇：色譜純。3.1.4丙酮。3.1.5二氯甲烷。3.1.6提取溶液（異丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80 , v:v:v）:取異丙醇50mL、二氯甲烷50mL , 用甲醇稀釋至500 mL,混勻。3.1.7 0.1%甲酸水溶液：取甲酸 1 mL用水稀釋至1 000 mL ,用濾膜（3.4）過濾后備用。3.1.8 0.1%甲酸甲醇溶液：取甲酸 1 mL用甲醇稀釋至1000mL ,用濾膜（3.4）過濾后備用。 3.2標(biāo)準(zhǔn)品維生素A、維生素A醋酸酯、維生素 D2、維生素D3、維生素E、維生素E

3、醋酸酯、維生 素心、維生素K2、3胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見附錄 A表A.1，純度 98%3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100卩g/mL3.3.1.1維生素K1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取 0.01 g （精確至0.000 1 g）的維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品（3.2）,加入 5mL 丙酮（ 3.1.4）溶解，用甲醇轉(zhuǎn)移并定容于100 mL 棕色容量瓶中。3.3.1.2 3胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取3胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（3.2） 0.01 g （精確至0.000 1 g ）,用二氯甲烷（ 3.1.5）溶解，轉(zhuǎn)移并定容至 100 mL 棕色容量瓶中。3.3.1.3維生素

4、A、維生素A醋酸酯、維生素 D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維 生素 心標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取 0.01 g （精確至0.000 1 g ）的維生素A、維生素A醋酸酯、 維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素 K2標(biāo)準(zhǔn)品（3.2），用甲醇溶解， 轉(zhuǎn)移并定容至 100 mL 棕色容量瓶中。3.3.2 空白基質(zhì)溶液的配制取空白試樣按照試樣制備方法 （5.2）操作。3.3.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液配制準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.3.1）適量，用空白基質(zhì)溶液稀釋。此溶液中維生素A、維生素A醋酸酯、維生素 D2含量為0.01卩g/mL 0.02卩g/mL 0.05卩g/mL 0.1卩

5、g/mL 0.5卩g/mL維 生素D3含量為0.02卩g/mL 0.05卩g/mL 0.1卩g/mL 0.5卩g/mL 1卩g/mL維生素 E、維生素 E醋酸酯含量為 0.1卩g/mL 0.5卩g/mL 1卩g/mL 5卩g/mL 10卩g/mL維生素 K1、維生素 a 含量為0.005卩g/mL 0.01卩g/mL 0.05卩g/mL 0.1卩g/mL 0.25卩g/mL 3胡蘿卜素含量為 0.05 卩 g/mL 0.1 卩 g/mL0.5 卩 g/mL1 卩 g/mL 2.5 卩 g/mL臨用時(shí)配制。注： 操作過程應(yīng)在避光環(huán)境下進(jìn)行。3.4微孔濾膜：0.22皿，有機(jī)相。4 儀器和設(shè)備4.1

6、 高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有大氣壓化學(xué)離子源。4.2 超聲波清洗器。4.3分析天平：感量分別為 0.01 g 和0.000 1 g。5 分析步驟5.1 試樣制備將 20 粒片劑或膠囊試樣粉碎后混勻，液體試樣混合均勻。5.2 試樣提取準(zhǔn)確稱取混合均勻的試樣 2g （精確至0.01 g ）于50 mL棕色容量瓶中，加入 40 mL提取 溶液（3.1.6）,超聲20 min，冷卻至室溫，用提取溶液（3.1.6）定容至刻度，搖勻，上清液經(jīng) 微孔濾膜（ 3.4）過濾，供液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。注： 操作過程應(yīng)在避光環(huán)境下進(jìn)行。5.3 儀器參考條件5.3.1 色譜條件a）色譜柱：C18柱，1.7

7、 啊100 mmx 2.1 mm （內(nèi)徑），或性能相當(dāng)者。 42 b） 流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液（3.1.7）, B為0.1%甲酸甲醇溶液（3.1.8）,洗脫梯度見表1。c）流速：0.5 mL/min。d）柱溫：35C。e）進(jìn)樣量：5譏表1洗脫梯度時(shí)間（min）流動(dòng)相A （%）流動(dòng)相B （ %）01585301008.501008.5115851015855.3.2質(zhì)譜條件a）電離方式：大氣壓化學(xué)正離子模式。b）檢測方式：多反應(yīng)檢測（ MRM ）。c）霧化氣壓力：45psi。d） 離子噴霧電壓：4500V。e） 干燥氣溫度：200 C （測定維生素 D2）、350 C （測定其余8種維生

8、素）。f） 干燥氣流速：6 L/min。g） 定性離子對(duì)、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量見表2。表2脂溶性維生素的定性離子對(duì)、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量中文名稱母離子（m/z）子離子（m/z）碎裂電壓（V）碰撞能量（eV）維生素A269.293.1* ; 81.213522 ; 22維生素A醋酸酯328.193.1* ; 81.213522 ; 22維生素D2397.369.2*; 107.313518 ; 35維生素D3385.3367.2* ; 259.11355 ; 5維生素E431.4165.2* ; 137.31355 ; 40維生素E醋酸酯473.3207.3* ; 165.310

9、08 ; 30維生素K1451.1187.2* ; 57.313520 ; 30維生素K2445.2187.3* ; 81.213520 ; 403胡蘿卜素538.4177.2* ; 121.310010 ; 20* :定量離子5.4定性測定按照上述條件測定試樣和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中的某種組分一致（變化范圍在±.5%之內(nèi)）；試樣中定性離子對(duì)的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度（）50> 2050> 10

10、20允許的最大偏差（）±20±25±30±505.5定量測定5.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.3）分別按儀器參考條件（5.3）進(jìn)行測定，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液 的色譜峰面積。以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線。5.5.2試樣溶液的測定將試樣溶液（5.2）按儀器參考條件（5.3）進(jìn)行測定，得到相應(yīng)的樣品溶液的色譜峰面積。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中組分的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次；試樣待測液響應(yīng)值若低 于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，應(yīng)取5.2中試樣提取續(xù)濾液進(jìn)行分析；試樣待測液響應(yīng)值若超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，應(yīng)用提取溶

11、液（3.1.6）稀釋后進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖參見附錄B的圖B.1-B.9。6結(jié)果計(jì)算結(jié)果按式（1）計(jì)算：c xV 漢 100X （1）m式中：X試樣中某種組分的含量，單位為微克每百克（卩g/100g；c由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣液中某種組分的濃度，單位為微克每毫升（卩g/mL;V試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）;m試樣稱取的質(zhì)量，單位為克（g）;計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有 效數(shù)字。7精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。8其他當(dāng)稱樣量為2.00 g,定容體積為50 mL時(shí)，維生素A、維生素A醋酸酯、維生素

12、 D?檢出 限為8卩g/100g定量限為 25卩g/100g維生素 D3、維生素 E檢出限為15卩g/100g,定量限為 50卩g/100g維生素E醋酸酯、維生素 心、維生素 ©檢出限為4卩g/100g定量限為12.5卩g/100g 3-胡蘿卜素檢出限為 40卩g/100g定量限為125卩g/100g附錄A脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品信息表A.1脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量序號(hào)中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子量1維生素AReti nol_ 68-26-8 _C20H30O286.452維生素A醋酸酯Reti nol Acetate127-4

13、7-9C22H32O2328.493維生素D2Calciferol50-14-6C28H44O396.654維生素D3Cholecalciferol67-97-0C27H44O384.645維生素EaTocopherol59-02-9C29H50O2430.716維生素E醋酸酯Tocopheryl Acetate7695-91-2C31H52O3472.747維生素KiPhytome nadi one84-80-0C31H46O2450.718維生素K2Farnoquinone11032-49-8C16H16O2 (C5H8)3444.669禺胡蘿卜素3-Carote ne7235-40-7C

14、40H 56536.87附錄B脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖TTFT11522.5A< quis ticxi I itf fm n)* MRM (269 0 > 93 0) SB 2 d* MRM (269 0 > 93 0 s6 ? dAcquis lion T ppn (m n)o1XadnooX 営匸mo圖B.1維生素A色譜圖(397.0&9.0) s6-2.dI1.634 min.圖B.2維生素A醋酸酯色譜圖0 B-0 7060 J0 4-Acquis tion 1 iri't -.rn r)Ac qui$ tion Tiri'i圖B.4維生素D3色

15、譜圖MR Mi (473 0 > 207 0) $6 2 d圖B.3維生素D2色譜圖-MRM (431 0 -> 1G5 0) sG-2 dAcqiis Liun 1 ron iX1Q2-1 s-1 61 41 2t0 B-0 60 4-1I44.5Acquisrtion Tima (min)圖B.5維生素E色譜圖圖B.6維生素E醋酸酯色譜圖-MRM '4S1 0 = 1X71門-1.510 sfi-2d *1 irit"surwoa 1A7 0i s6-2 rtAcquisition Tim*! n) 圖B.7維生素Ki色譜圖 MRM 齒37占-> 177