食品生物技術(shù)導(dǎo)論課程論文

1、食品生物技術(shù)課程論文題目:PCR技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展院系:食品學(xué)院食品質(zhì)量與安全系班級:10級(3班姓名:王桐學(xué)號:2010511147PCR技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展王桐摘要:PCR (polymerase chain reaction技術(shù),即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù),又稱基因體外擴(kuò)增技術(shù)或和核酸體外擴(kuò)增技術(shù),利用兩種與相反鏈雜交并利用附著于目標(biāo)DNA兩端的寡核苷酸引物在高溫(95°C使目標(biāo)DNA片斷的DNA雙鏈變性,分解為單鏈,在較低溫度(37-63°C與引物退火,然后變溫到72°C左右。在耐高溫DNA聚合物酶的作用下引物被沿樣板DNA單鏈延伸合成互補(bǔ)鏈,然后有變性退火延伸反復(fù)進(jìn)行

2、。引物大大過量,d NTP過量,酶在高溫中是較穩(wěn)定的,這樣經(jīng)過幾十個循環(huán),目標(biāo)DNA片斷就按2的n次方遞增,用此法可以從mRNA 中,c DNA庫中擴(kuò)出目標(biāo)基因。總之,生物體內(nèi)核酸的復(fù)制是半保留復(fù)制,PCR 技術(shù)就是在體外對此進(jìn)行復(fù)制模擬。關(guān)鍵詞:PCR技術(shù)原理食品應(yīng)用免疫PCR 轉(zhuǎn)基因食品PCR是我們研究分子生物學(xué)的重要方法和工具,隨著科技的不斷發(fā)展,這種技術(shù)越來越被人們看重,越來越多的應(yīng)用到我們的科技研究之中,作為食品質(zhì)量的檢驗工作者,這種技術(shù)也是我們必須掌握的。下面就對部分內(nèi)容做出介紹。聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR,又稱無細(xì)胞克隆

3、技術(shù)(“free bacteria” cloning technique,是一種對特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法。1985年美國PE-Cletus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。該方法一改傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的模式,不通過活細(xì)胞,操作簡便,在數(shù)小時內(nèi)可使幾個拷貝的模板序列甚至一個DNA 分子擴(kuò)增107108倍,大大提高了DNA的得率。已廣泛應(yīng)用到了各個領(lǐng)域。一、PCR技術(shù)的基本原理:PCR技術(shù)由三個步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成:高溫變性、低溫退火和適溫延伸。高溫變性,在高溫(95條件下,待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板;低溫退火,在低溫

4、(3755情況下,兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合,形成部分雙鏈;適溫延伸,即在特異耐熱酶-TaqDNA聚合酶的最適溫度(72時,引物3端為合成的起點,以單核苷酸為原料,沿模板以53方向延伸,合成新的DNA鏈1。新合成的DNA雙鏈又可作為擴(kuò)增模板,反復(fù)進(jìn)行解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán),每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍, PCR產(chǎn)物得以2n 的指數(shù)形式迅速擴(kuò)增,經(jīng)過2530個循環(huán)后,理論上可使基因擴(kuò)增109 倍以上,實際上可達(dá)106 107 倍。二、PCR的要素基本的PCR須具備:1.要被復(fù)制的DNA模板(Template2.界定復(fù)制范圍兩端

5、的引物(Primers.3.DNA聚合酶(Taq. Polymerase4.合成的原料及水。PCR的反應(yīng)包括三個主要步驟,分別是1. Denaturation2. Annealing of primers, and3. Extension of primers。所謂Denaturing乃是將DNA加熱變性,將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板. 而Annealing 則是令Primers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端。最后在DNA聚合酶(e.g. Taq-polymerase 的作用下進(jìn)行引物的延長(Extension of primers及另一股的合成。三、PCR技術(shù)的具體

6、應(yīng)用例舉PCR在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用我國食品科學(xué)技術(shù)發(fā)展及對外貿(mào)易需要,食品檢測和分析工作已提高到一個極其重要地位。特別是轉(zhuǎn)基因食品技術(shù)迅猛發(fā)展,轉(zhuǎn)基因食品安全性問題逐漸被人們所重視,轉(zhuǎn)基因食品是否安全、轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識制度能否被嚴(yán)格執(zhí)行,關(guān)鍵在于是否有準(zhǔn)確、可靠檢測技術(shù)作保障。它能快速,簡便的在體外擴(kuò)增特定的DNA片段,具有高度的專一性和靈敏度。該技術(shù)自問世以來,就以驚人速度廣泛應(yīng)用于生物及食品科學(xué)眾多領(lǐng)域,在食品轉(zhuǎn)基因成分檢測方面具有很大潛在價值。例如我們可以利用PCR技術(shù)來辨別轉(zhuǎn)基因食品,轉(zhuǎn)基因食品又稱基因改性食品。從狹義上來說,是利用分子生物學(xué)技術(shù),將某些(包括動物、植物及微生物一種或

7、幾種外源性基因轉(zhuǎn)移到其它生物物種中去,從而改造生物遺傳物質(zhì)使其有效表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物(多肽或蛋白質(zhì),以轉(zhuǎn)基因生物為加工原料加工而成食品就是轉(zhuǎn)基因食品。轉(zhuǎn)基因食品是否安全一直是人們爭論不休問題,目前,主要存在以下幾個方面問題:外源基因不是自然遺傳基因,它的結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定?在人體內(nèi)是否會發(fā)生突變而有害人體健康?是否會增加食物過敏?植物里引入具有抗除草劑或殺害蟲功能基因后,它是否也象其它有害物質(zhì)一樣能通過食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)?基因轉(zhuǎn)入后是否會產(chǎn)生新的有害遺傳性狀或不利于健康成分?對轉(zhuǎn)基因食品安全性評價,國際上最受認(rèn)同的是“實質(zhì)等同性”(substantial原則。該原則認(rèn)為,如果導(dǎo)入基因后產(chǎn)生蛋白質(zhì)經(jīng)確認(rèn)是安全

8、的,或是轉(zhuǎn)基因作物和原作物在主要營養(yǎng)成分、形態(tài)和是否產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)因子、毒性物質(zhì)、過敏性蛋白質(zhì)等方面沒有發(fā)生特殊變化的話,則可認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物在安全性上和原作物是等同的。1. PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因食品目前,對轉(zhuǎn)基因食品檢測主要是檢測是否有外源基因或DNA,檢測是否有外源蛋白質(zhì), PCR技術(shù)主要用于檢測轉(zhuǎn)基因食品中是否有外源基因或DNA。外源基因中目的基因是轉(zhuǎn)基因食品開發(fā)中研究重點,隨著轉(zhuǎn)基因食品種類不同,所使用目的基因也不相同,因此通過檢測外源基因中目的基因鑒別轉(zhuǎn)基因食品難度較大。然而即使在含有不同目的基因的轉(zhuǎn)基因食品中往往使用相同或相似啟動子、終止子或標(biāo)志基因,這些啟動子、終止子和標(biāo)志基因DNA

9、序列具有特異性,且大多來自微生物,非植物本身固有,因此通過檢測樣品是否含有特定啟動子、終止子或標(biāo)志基因序列作為鑒別轉(zhuǎn)基因食品依據(jù)是一種可行方法。1.1 PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用根據(jù)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中常用花椰菜葉病毒啟動子(CaMV 35s和根癌農(nóng)桿菌終止子(NOS序列,設(shè)計并合成兩對不同引物和相對應(yīng)兩種熒光雙鏈探針(FDCP,分別建立常規(guī)PCR、應(yīng)用FDCP新型實時熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因成分35S啟動子和NOS終止子方法。試驗結(jié)果表明,兩種PCR方法均能有效檢測出35S和NOS片段,其中常規(guī)PCR方法具有靈敏度高、特異性好之特點;應(yīng)用FDCP新型實時熒光PCR方法則更為簡便、快速、準(zhǔn)確。應(yīng)

10、用PCR 技術(shù)對轉(zhuǎn)基因(GM玉米及其粗加工食品如:爆玉米花、熱玉米棒、速溶玉米片中通常轉(zhuǎn)入基因構(gòu)建元件35S啟動子、NOS終止子和外源抗蟲GrvLA(b目的基因進(jìn)行檢測,對GM玉米檢測低限可達(dá)到0.1%。劉垣等在研究轉(zhuǎn)基因大豆DNA檢測芯片時,在對PCR反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交條件進(jìn)行優(yōu)化同時,比較芯片檢測特異性和重復(fù)性,并對檢測靈敏度進(jìn)行測試。2. PCR在食品微生物檢測中的應(yīng)用PCR技術(shù)檢測微生物的基本原理是在被檢測微生物核酸序列, 在PCR體系下經(jīng)高溫變性、低溫退火、適溫延伸三步循環(huán)將單個核酸分子序列以2的指數(shù)進(jìn)行大量復(fù)制擴(kuò)增的過程。即在檢測時, 被檢測微生物雙鏈DNA 序列在94變性解

11、鏈成雙鏈, 55特異性引物與單鏈DNA 結(jié)合, 72在引物的引導(dǎo)延伸復(fù)制檢測微生物DNA 序列。以上三步進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增得到大量的被檢測微生物DNA 序列, 最后一般在凝膠電泳下檢測目的DNA。理論上只要樣品中有一個分子的微生物就可以在短時間內(nèi)用PCR 技術(shù)檢測到。食品中污染微生物種類很多, 即使是同一種食品中微生物種類也有很多, 用傳統(tǒng)的方法檢測食品中微生物要分離出所有的微生物很困難。特別是在檢測食品中的弱勢菌時, 可能很難用傳統(tǒng)的方法檢測出來, 特別是有些微生物很難培養(yǎng), 而用PCR 技術(shù)檢測這些微生物可以避免這些問題, 因此, 利用PCR 技術(shù)能夠比較準(zhǔn)確地檢測食品中微生物。3. 免疫PCR

12、檢測技術(shù)及其在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基礎(chǔ)免疫學(xué)個免疫化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,生命科學(xué)研究漸漸上升到一個多角度,多層次的高度,然而,盡管目前的分析精度已經(jīng)從磁暴水平提高到分子水平,微量檢測依然是生命科學(xué)研究中有待提高的方面。酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme-liked immune sorbent assay, ELISA利用抗原或者抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。具有恩干的特異性和敏感度。PCR技術(shù)能在短時間內(nèi)把目的DNA放大百萬倍,但它的對象只限于DNA和RNA。1992年Sano等將ELISA和PCR結(jié)合在一起,建立拉人一種新型的檢測技術(shù)即免疫PCR(immune-P

13、CR,QI PCR。該技術(shù)結(jié)合了EUSA的高特異性和PCR的高度靈敏性,可以檢測一系列可分析的靶標(biāo),而且將檢測的靈敏度提高了幾個數(shù)量級,著在很大程度上解決了很多物質(zhì)的微量檢測問題。技術(shù)原理包括,a包被,b橋聯(lián),c PCR 以及結(jié)果顯示分析。食品安全中帶檢測物質(zhì)種類多樣,因此,開發(fā)針對食品安全的免疫PCR 試劑盒也將具有極為重要的意義。免疫PCR試劑和可以使免疫PCR的操作標(biāo)準(zhǔn)化從而避免因污染造成的假陽性和結(jié)果不穩(wěn)定等一系列問題。4. PCR技術(shù)在檢測食品中有害微生物的應(yīng)用4.1監(jiān)測食品中的沙門氏菌沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義的人畜共患病之一,病原屬腸桿菌科,蛋、家畜和肉制品等都是主要的傳

14、播媒介。1993年Song等人利用PCR樣品增菌后,采用快速裂解吸附法制備模板,用多重PCR同時檢測EHEC的3種毒力基因eaeA、hlyAB、slt1/ 2 ,相應(yīng)擴(kuò)增片段依次為1109、302、228 bp。檢測了60株大腸桿菌和其它菌種,結(jié)果12株大腸桿菌0157 : H7、1株大腸桿菌026 : H11和1株大腸桿菌0111:H8 ,同時檢出上述3種基因,2株EAEC檢出了eaeA基因,1株V TEC檢出了slt1/ 2基因,其余43株大腸桿菌和非大腸桿菌未檢出上述基因。檢測食品中EHEC時,從樣品增菌培養(yǎng)到整個檢測過程結(jié)束不超過8 h,方法的檢出限116 cfu/ g (mL。檢測的

15、126份食品樣品中,3份檢出了E2 HEC(包括牛肉、豬肉和生菜各1份。試驗結(jié)果表明,該法是一種特異性強(qiáng)、敏感性高、省時、省力的EHEC檢測方法。4.2 檢測肉毒梭狀芽孢桿菌肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素,在天然物質(zhì)中毒力最強(qiáng)。據(jù)報道,Nooki根據(jù)毒素A基因的非重復(fù)區(qū)段設(shè)計了兩對特異性引物(NK1 N K2和NK3 -NK2分別用于擴(kuò)增長度為546 bp和252 bp的特異片段;又根據(jù)毒素A基因的重復(fù)區(qū)段序列,設(shè)計了另外一對引物NK11-NK9,用于擴(kuò)增長度為1 266 bp的特異片段。此三對引物都能快速、特異地從肉食品樣品中檢測出肉毒梭狀芽孢桿菌。5. PCR技術(shù)在食品成分測定方面的應(yīng)

16、用5.1 動物源性成分的測定近年來，瘋牛病、羊癢病及禽流感等疾病通過食品的傳播，由于食品安全性與質(zhì)量監(jiān)督 的需要及宗教信仰等問題，有必要對食品中的動物源成分進(jìn)行檢測，僅靠傳統(tǒng)的外觀鑒別， 無法準(zhǔn)確判定其實際成分。PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于動物肉類的物種檢測與飼料中的動物 成分檢測。陳文炳20等，應(yīng)用了 PCR 技術(shù)檢測 12 種加工食品中豬、牛、羊、雞等動物源 性成分，并開發(fā)了真核生物所共有的 18S 核糖體 DNA(18S rDNA與食品中多種動物物種特 異性基因片段之間的二重 PCR 檢測方法，以提高檢測效率與準(zhǔn)確性，節(jié)約檢測成本。王麗 媛21等，利用單重 PCR 和多重 PCR 對部分市

17、售肉制品進(jìn)行檢測，以確定食品中是否含有 動物源性成分及其含量。此方法操作簡便，快速準(zhǔn)確，節(jié)省費(fèi)用。 植物源性成分的測定 我國是一個農(nóng)產(chǎn)品出口大國，加入 WTO 后，隨著農(nóng)產(chǎn)品出口量的增加，國外對出口食品質(zhì) 量的要求也隨之提高。為確保食品的品質(zhì)和安全，為我國食品的進(jìn)出口貿(mào)易嚴(yán)格把關(guān)，保證 我國人民日常生活的食品安全和生命健康。 因此， 開發(fā)出準(zhǔn)確方便的鑒定食品有效成分的方 法，具有重大意義。陳文炳22等本研究以豆粉與豆奶粉中的大豆成分(內(nèi)源 Lectin 基因 、 食品中的玉米(IVR 基因、馬鈴薯(PATA 基因、番茄(PG 基因等成分以及真核生物中普遍 存在的核糖體 DNA(18S rDNA

18、片段為研究對象，進(jìn)行單一與二重 PCR 擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物作 為分子標(biāo)記， 建立加工食品中植物源性有效成分的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)， 為食品質(zhì)量與安全 管理提供技術(shù)支持。 此外，PCR 技術(shù)還可用于鑒定食品的原料種類和原產(chǎn)地。丁小余23 等，利用 PCR 技術(shù)對鑒別保健食品建澤瀉及其混淆品，簡便快捷、重復(fù)性好、分辨率高。 同時，PCR 技術(shù)還應(yīng)用于病毒檢測，瘋牛病病毒、乙肝病毒、SARS 病毒都可通過此方法快 速檢測出來，且靈敏度較高。利用巢式 PCR 檢測食源性 SARS 病毒靈敏度高。 三、PCR 技術(shù)的前景與發(fā)展 K.B. Mullis1983 年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA 序

19、列的方法 ,故又稱為 基因的體外擴(kuò)增法 ,也稱為無細(xì)胞克隆系統(tǒng)。它可以在試管中建立反應(yīng) ,數(shù)小時后能將極其 微量的目基因或某一特定的 DNA 片段擴(kuò)增數(shù)十萬倍 ,乃至千百萬倍 ,并且無須通過煩瑣費(fèi) 時的基序便可以獲得足夠數(shù)量的精確的 DNA 拷貝 1。隨著人們對食品安全性要求的不斷 提高 , PCR 技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高和快速準(zhǔn)確等優(yōu)點在食品檢測領(lǐng)域得以廣泛的應(yīng) 用。隨著各種轉(zhuǎn)基因植物迅速發(fā)展，由此衍生而來轉(zhuǎn)基因食品數(shù)量也迅速增加，并引起社會 各界對轉(zhuǎn)基因食品爭論，轉(zhuǎn)基因食品安全不僅是科學(xué)領(lǐng)域問題，也是經(jīng)濟(jì)、政治等領(lǐng)域關(guān)心 問題，同時也關(guān)乎到每一個人切身利益。為了促進(jìn)轉(zhuǎn)基因食品健康發(fā)展，各國政府對轉(zhuǎn)基因 食品研制、生產(chǎn)及銷售環(huán)節(jié)都制定相關(guān)管理條例，轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識也被歐、美及我國政府列 為強(qiáng)制性措施。 轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識制度能否順利實行關(guān)鍵在于能否建立準(zhǔn)確可靠轉(zhuǎn)基因食品鑒 別技術(shù)。 利用 PCR 方法檢測轉(zhuǎn)基因食品中外源基因是目前國內(nèi)外常用轉(zhuǎn)基因食品鑒別技術(shù)， 因而 PCR 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測中越來越顯重要。但 PCR 準(zhǔn)確性仍受很多因素影響，如提 取 DNA 性質(zhì)，PCR 反應(yīng)抑制物等，所以在實際應(yīng)用中，PCR 檢測轉(zhuǎn)基因食品方法不斷被改 進(jìn)和完善。如 QCPCR(定量競爭 PCR法，該方法對外源基因既能定性又能定量。PC