酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)庚型肝炎病毒抗體

1、    酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)庚型肝炎病毒抗體        【摘要】目的探討抗庚型肝炎病毒(HGV)IgG與各種病毒感染、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及HGV RNA的相關(guān)性。方法用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)了315例各種肝炎病毒(AE)感染者和117例健康獻(xiàn)血員血清的抗-HGV IgG，并測(cè)定其ALT，對(duì)抗-HGV IgG陽(yáng)性的標(biāo)本用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)HGV RNA。結(jié)果獻(xiàn)血員抗-HGV IgG的陽(yáng)性率為3.42%(4/117)，非AE、HAV、H

2、BV、HCV、HEV、HBV和HCV、HBV和HDV、HBV和HEV病毒感染者抗-HGV IgG陽(yáng)性率分別為5.95%(5/84)，0(0/3)，3.75%(3/80)，17.28%(14/81)，0(0/15)，33.33%(5/15)，3.33%(1/30)，16.66%(1/6)；抗-HGV IgG和HGV RNA的相關(guān)性為30.30%(10/33)，抗-HGV IgG陽(yáng)性標(biāo)本中ALT升高率為33.33%(11/33)。結(jié)論HGV可以單獨(dú)或/和HBV、HCV合并感染機(jī)體且與HCV密切相關(guān)，HGV和HCV合并感染將增加肝臟的損傷程度?！局黝}詞】抗體，病毒；IgG；RNA，病毒；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶

3、；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定；肝炎病毒，庚型 Detection of IgG antibody to hepatitis G virus by ELISAZHENG YouweiLIANG Minwen WANG Jingjian（ Guangdong Provincial People's Hospital, Guangzhou 510080, China）【Abstract】ObjectiveTo study the relation of HGV IgG antibody (anti-HGV IgG) to various viral infections, ALT and HGV RN

4、A.MethodsTo detect anti-HGV IgG from 315 persons infected with various viruses hepatitis (AE) and 117 healthy blood donors by ELISA. The detection of ALT of these peoples, and detect HGV RNA of the samples of positive anti-HGV IgG by RT-PCR were also carried out.ResultsThe positive rate of anti-HGV

5、IgG of 117 blood donors was 3.42%(4/117),and that of the people infected by non AE,HAV,HBV,HCV,HEV,HBV and HCV, HBV and HDV, HBV and HEV were 5.95%(5/84),0(0/3),3.75%(3/80),17.28%(14/81),0(0/15),33.33%(5/15),3.33%(1/30),16.66%(1/6), respectively. The relativity of anti HGV IgG and HGV RNA was 30.30%

6、(10/33), and 33.33% of ALT level in the antibody positive samples were elevated.ConclusionHGV may infect people alone, or coinfect with HBV or /and HCV, but is highly relative to HCV, and the coinfection of HGV with HCV may increase the degree of liver damage.【Key words】Antibody, viral;IgG;RNA, vira

7、l;Alanine aminotransferase (ALT);Engyme-linked immunosorbent assay;Hepatitis G virus1995年發(fā)現(xiàn)的庚型肝炎病毒(HGV)是黃病毒科病毒的一個(gè)新成員，可引起與丙型肝炎相似的病變。目前檢測(cè)HGV主要是采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。國(guó)內(nèi)近年也生產(chǎn)了以人工合成HGV多肽或基因重組HGV蛋白為固相抗原來(lái)檢測(cè)特異性抗-HGV IgG的ELISA試劑盒，但臨床報(bào)道很少。我們用ELISA法檢測(cè)了315例各種肝炎病毒(AE)感染者和117例健康獻(xiàn)血員血清的抗-HGV IgG，并檢測(cè)其ALT，對(duì)抗-HGV IgG陽(yáng)性

8、的標(biāo)本用RT-PCR法檢測(cè)HGV RNA，以探討抗-HGV IgG與各種肝炎病毒感染者、ALT及HGV RNA的相關(guān)性。1材料和方法1.1標(biāo)本來(lái)源血清標(biāo)本來(lái)自廣東省人民醫(yī)院門診和住院病人及獻(xiàn)血員，其中315例為AE型肝炎病毒感染者，117例為健康獻(xiàn)血員。1.2方法及試劑抗-HAV IgM、HBsAg、抗-HCV IgG、抗-HDV IgM和抗-HEV IgM的檢測(cè)均采用ELISA法，試劑均由廣東省中山生物工程公司生產(chǎn)并提供，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書操作；ALT的檢測(cè)用酶速率法測(cè)定，試劑由美國(guó)BECKMAN公司提供。HGV RNA的檢測(cè)采用RT-PCR法(引物設(shè)計(jì)在5非編碼區(qū))，由第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院醫(yī)

9、學(xué)基因技術(shù)中心提供試劑并檢測(cè)；抗-HGV IgG的檢測(cè)采用ELISA法，試劑(批號(hào)為HGV0121，包被抗原分別來(lái)源于E區(qū)、NS3區(qū)和NS4區(qū)的三種合成多肽)由香港SINOCLONE有限公司生產(chǎn)，廣東省中山生物工程公司提供，操作按試劑說(shuō)明書進(jìn)行，其有效時(shí)陽(yáng)性對(duì)照的吸光度A值應(yīng)大于1.0，陰性對(duì)照的A值應(yīng)小于0.1；待測(cè)標(biāo)本的A值大于Cut off值為陽(yáng)性，小于或等于Cut off值為陰性(Cut off=0.25+陰性對(duì)照的A值)。1.3主要儀器美國(guó)BIO-RAD Model 3550-UV酶標(biāo)儀、美國(guó)BECKMAN Cx7生化自動(dòng)分析儀和美國(guó)PE-480基因擴(kuò)增儀。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用2檢驗(yàn)

10、。2結(jié)果432例(315+117)標(biāo)本抗-HGV IgG陽(yáng)性33例(7.64%)，其中10例HGV RNA陽(yáng)性，抗-HGV IgG和HGV RNA兩者的相關(guān)性為30.30%(10/33)；以ALT>35IU/L為升高，除獻(xiàn)血員外，29例抗HGV-IgG陽(yáng)性標(biāo)本中ALT升高11例(37.93%)。10組標(biāo)本的抗-HGV IgG和HGV RNA的檢出率均不同(表1)，其中HBV感染者與HBV和HDV合并感染者、HCV感染者與HBV和HCV合并感染者抗-HGV IgG陽(yáng)性率均沒(méi)有差異(前者P>0.5,2=0.22；后者P>0.5,2=0.08)。抗-HGV IgG陽(yáng)性率最高的是HB

11、V和HCV合并感染者(33.33%)，其次為HCV感染者(17.28%)；抗-HGV IgG和HGV RNA相關(guān)性最高的是HBV和HEV合并感染者(100%)，其次為HCV感染者(50.00%)。各組抗-HGV IgG和ALT的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。除與HCV合并感染造成該組ALT顯著性升高(P<0.005)外，其他各組合并感染造成ALT升高均沒(méi)有差異(P>0.5)。3討論體外實(shí)驗(yàn)表明，HGV為嗜肝病毒，傳播方式以血、血制品及相關(guān)途徑為主。HGV感染的診斷目前主要運(yùn)用PCR來(lái)檢測(cè)病毒RNA，并認(rèn)為引物設(shè)計(jì)在5非編碼區(qū)時(shí)檢測(cè)更靈敏1，而RT-PCR和套式PCR靈敏度也不同2。本研究中抗-H

12、GV IgG和HGV RNA的相關(guān)性僅為30.30%，提示雖然PCR檢測(cè)方法很靈敏，但其在疾病檢測(cè)中真正的靈敏度和專一性未知，PCR檢測(cè)有可能降低HGV感染的檢出率，尤其是那些感染后康復(fù)或病毒不活躍復(fù)制的患者。ELISA法檢測(cè)抗-HGV IgG則可克服上述缺點(diǎn)，而且方便、快捷。結(jié)果提示，HGV可以單獨(dú)或/和HBV、HCV合并感染機(jī)體而很少單獨(dú)與HAV或HEV合并感染機(jī)體，這可能由于HGV、HBV和HCV有著共同的易感染因素；HBV和HCV合并感染的病人抗-HGV IgG陽(yáng)性率最高(33.33%)，其次為HCV感染的病人(17.28%)，然而抗-HGV IgG和HGV RNA的相關(guān)性最高則為后者

13、；提示HCV感染或合并感染HCV的病人感染HGV概率較高，這與Linner等3認(rèn)為HGV和HCV密切相關(guān)并在慢性HCV感染的病人中普遍存在HGV感染相一致。HBV和HEV合并感染者抗-HGV IgG陽(yáng)性率高達(dá)16.66%，抗-HGV IgG和HGV RNA相關(guān)性為100%，但例數(shù)太少(6例)并沒(méi)有太大的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBV感染與HBV和HDV合并感者、HCV感染者與HBV和HCV合并感染者的抗-HGV IgG陽(yáng)性率均無(wú)差異，提示HBV和HDV、HBV和HCV合并感染并不增加HGV感染的概率。表110組標(biāo)本抗-HGV IgG和HGV RNA的檢測(cè)結(jié)果Tab.1Detection of anti-H

14、GV IgG and HGV RNA in samples.標(biāo)本Samples例數(shù)Case No.抗-HGV IgG數(shù)(%)No.anti-HGV IgG(%)HGV RNA數(shù)(%)No.HGV RNA(%)獻(xiàn)血員Blood donors1174(3.42)0(0)NonA-E845(5.95)1(20.00)HAV30(0)0(0)HBV803(3.75)1(33.33)HCV8114(17.28)7(50.00)HEV150(0)0(0)HBV，HCV155(33.33)1(20.00)HBV，HDV301(3.33)0(0)HBV，HEV61(16.66)1(100)HBV，HCV，HD

15、V，HEV10(0)0(0)     從生物化學(xué)變化上看，抗-HGV IgG陽(yáng)性的病人，只有37.93%ALT活性升高。非AE肝炎病毒感染者由于HGV感染造成ALT升高和不明原因造成ALT升高無(wú)差別，HCV合并感染HGV的病人ALT升高的百分率卻顯著高于單純HCV感染的病人；提示單獨(dú)的HGV感染不一定會(huì)引起ALT升高，HCV合并HGV感染后會(huì)加重肝臟組織的損傷程度。HBV感染者與HBV和HEV合并感染者再合并感染HGV對(duì)ALT升高影響也不大。與HBV和HCV合并感染者相比，HBV、HCV和HGV三種病毒合并感染者的ALT升高的比例并不顯著增加，這可能是由

16、于多重病毒感染存在病毒干擾作用。盡管目前對(duì)HGV單獨(dú)感染是否引起肝炎尚有爭(zhēng)議，但汪興太等4用HGV感染5只我國(guó)獼猴時(shí)發(fā)現(xiàn)4只均出現(xiàn)ALT升高，證明HGV感染可引起肝炎。HGV單獨(dú)感染或與其他病毒合并感染機(jī)體是否引起肝炎，可能與HGV感染的階段性和被感染者肝臟的補(bǔ)償功能有關(guān)。表2抗-HGV IgG與ALT的關(guān)系Tab.2Relation of ALT and anti-HGV IgG組別Groups抗HGV IgG陽(yáng)性Positive anti-HGV IgG抗HGV IgG陰性Negative anti-HGV IgGP值*P value*例數(shù)CaseALT升高數(shù)(%)No. elevated

17、 ALT(%)例數(shù)CaseALT升高數(shù)(%)No. elevated ALT(%)Non-AE53(60.00)7951(64.56)>0.5HBV31(33.33)7723(29.87)>0.5HCV147(50.00)6714(20.90)<0.005HBV+HCV54(80.00)106(60.00)>0.5HBV+HEV10(0.00)51(20.00)>0.5     *：同組抗-HGV IgG陽(yáng)性和陰性標(biāo)本的ALT升高例數(shù)的比較*:Comparison of the ALT level elevation rat

18、e between positive and negative anti-HGV IgG samples in the same group 正常獻(xiàn)血員和非AE肝炎病毒感染者HGV感染率分別為3.42%和5.95%；急性非甲戊型肝炎病人抗-HGV IgG陽(yáng)性率為44.44%(12/27)5。因此HGV感染的檢測(cè)對(duì)預(yù)防輸血后肝炎及診斷不明病因的非AE型肝炎十分重要。雖然ELISA法檢測(cè)抗-HGV IgG有可能較PCR法檢測(cè)HGV RNA靈敏度高，而且更方便、快捷，更適合臨床特別是獻(xiàn)血員篩選的需要；但目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上流通的ELISA法檢測(cè)抗-HGV IgG的試劑盒質(zhì)量參差不一。馬達(dá)等6對(duì)8種國(guó)產(chǎn)的抗

19、-HGV IgG試劑盒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)最少有37.5%(3/8)不合格，可能與這些試劑盒所選用的固相抗原的質(zhì)量等有關(guān)。貌盼勇等7采用固相多肽合成技術(shù)選擇合成了7條HGV不同區(qū)域的多肽即C區(qū)(?)的33肽(sp1)、18肽(sp2)、E區(qū)的20肽(sp3)、NS3區(qū)的18肽(sp4)、NS5a區(qū)的22肽(sp5)、NS5b區(qū)的25肽(sp6)和28肽(sp7)，并以上述多肽為固相抗原檢測(cè)非甲-戊肝炎病人和獻(xiàn)血員血清中抗-HGV抗體，發(fā)現(xiàn)7條多肽的反應(yīng)性和檢出率各不相同，并認(rèn)為以sp1、sp3、sp4和sp5等4條多肽為固相抗原間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)抗-HGV IgG抗體具有較高的特異性和敏感性。本實(shí)驗(yàn)用的試劑盒以HGV的E區(qū)、NS3區(qū)和NS4區(qū)三段不同區(qū)域的合成多肽為固相抗原，并對(duì)陰、陽(yáng)性對(duì)照和Gut off值都嚴(yán)格限制，這樣就保證了檢測(cè)結(jié)果的特異性和靈敏度。盡管目前國(guó)際上對(duì)ELISA法檢測(cè)抗-HGV IgG還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)，但其在臨床上的應(yīng)用勢(shì)在必行。所以，為了避免誤導(dǎo)臨床，應(yīng)對(duì)抗-HGV I