鹽負(fù)荷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈膠原含量及TGFβ1表達(dá)的影響

1、鹽負(fù)荷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈膠原含量及TGF3TGF3 1 1表達(dá)的影響作者=衛(wèi)娜，牟建軍，王寶莉，劉富強(qiáng)，黃強(qiáng)，張敏，蔣偉，吳冠吉【摘要】目的動(dòng)態(tài)觀察慢性鹽負(fù)荷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）胸主 動(dòng)脈膠原含量及TGF（3 1表達(dá)的影響，并探討其可能的機(jī)制。方法80只SHR隨機(jī)分為2組：4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)）高鹽飲食組（高鹽組，n=45）和0.4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）正常鹽飲食組（對(duì)照組，n=35）,持續(xù)干預(yù)16周。每 隔4隨機(jī)分批處死SHR每次每組6只），取胸主動(dòng)脈行Masson染色，觀 察 病理變化并計(jì)算主動(dòng)脈膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）,免疫組化法測(cè)定主動(dòng) 脈管壁 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3 1（TGF3 1）的蛋白表

2、達(dá)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)第4、& 周，高鹽組SHRfc動(dòng)脈CVF均較對(duì)照組增高（8 02士1.21）% vs.(6,87 2.15)%, (10,35 2.07)% vs. (8.21士1.02)%, (16.20 1,58)% VS. (15.31士2.13)%, (19.37 1,816)% vs, (18,7 1.9)%,（作者:單位:郵編:周監(jiān)測(cè)血壓、尿量及尿鈉。分別于實(shí)驗(yàn)第0、4、&12、16周時(shí)P0,05 0實(shí)驗(yàn)第4、8、12周時(shí)高鹽組SHR主動(dòng)脈TGF3 1的表達(dá)均較對(duì)照組增高(8 02士1.21)% VS. (6,87 2.15)%, (10.35 2.07)%VS, (

3、8.21士1.02)%, (16.20 1.58)% vs. (15.31士2.13)%, P0.05。結(jié)論慢性鹽負(fù)荷可使SHF胸主動(dòng)脈的膠原含量增加，而局部TGF3 1含量的升高可能是其致膠原含量增加的重要原因之一?！娟P(guān)鍵詞】高血壓；鹽負(fù)荷；膠原；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B1ABSTRACT: Objective To make a dyn amic observati on on the effect of chronicsalt loading on collagen content in thoracic aorta and theexpressionof TGF 3 1 in spontaneo

4、uslyhypertensive rats (SHR) and investigate the possible mechanism.Methods SHRs(80 in number, male, 4-5 weeks old) were assigned ran domly to receive4% (g/kg) high salt (HS groups, n=45) and 0,4% low salt (LS groups, n=35) for16 weeks. Blood pressure, urine volume and urinary sodium excreti on were

5、measuredevery four weeks. These rats were sacrificed ran domly at the start of this study,4th, Sth, 12th and 16th week, 6 rats in each group each time. The aorta wascollected and dyed with Mass on to observe the pathological change of thoracicaorta undermicroscope; microholography system was used to

6、 calculate collagen(CVF) of the aorta. Expression ofTGF 31 in SHR thoracic aorta was measured with immun ohistochemical method.Results CVF in thoracic aorta was in creased sig n ifica ntly in HS group compared with that inLS group at 4th, Sth, 12th and 16th week (P0.05). with Compared that in LSgrou

7、p, the expression of TGFp 1 in HSgroupvolumetric fractionwas in creased at 4th, Sth and 12th week(P0,05) . Con clusio n Chro nic saltloadi ng can in crease collage n content in thoracic aorta of SHR. Local TGF 31 in crease in duced by salt loadi ng in SHR is probably invo Ived in the development of

8、collage n in crease,KEY WORDS: hypertension; salt loading; collagen;tran sformi ng growth factor 3 1高鹽攝入不僅導(dǎo)致血壓升高，而且可造成腦卒中、冠心病發(fā)病危險(xiǎn)增加1。臨床研究表明，大動(dòng)脈順應(yīng)性減退是心腦血管事件發(fā)生的獨(dú) 立危險(xiǎn)因素2。而近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，鹽獨(dú)立于血壓之外可直接 導(dǎo)致血 管重構(gòu)、硬化和動(dòng)脈彈性功能下降。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察慢性鹽負(fù) 荷對(duì)自發(fā)性 高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat, SHR）胸 主動(dòng)脈膠原的影 響及其可能機(jī)制。1材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性4

9、5周齡SHR80只，購(gòu)自北京維通利華實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（動(dòng)物合格許可證編號(hào)SCXK京）2007擬0001 ）。普飼料（對(duì)照組，n=35）與4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的高鹽飼料（高鹽組，n=45）,其他條件一致。分別于實(shí)驗(yàn)第0、4、&12、16周時(shí)每組隨機(jī)選取6只，分批處死。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1血壓測(cè)量 大鼠35C預(yù)熱10min后采用BP以6動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)一周后，完全隨機(jī)法分為0.4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）正常鹽壓心率測(cè)定儀測(cè)量大鼠安靜、清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓，測(cè)量 次取均值。每4周監(jiān)測(cè)1次血壓。122尿量、尿鈉觀察 于實(shí)驗(yàn)第0、4、8 12、16周末用代謝 籠收集24h尿液，低速離心后取

10、上清液-20 C凍存?zhèn)溆?。采用火焰?度計(jì)法測(cè)定 尿Na+濃度，計(jì)算24h尿液NQ+非泄量。123主動(dòng)脈膠原染色及分析10Omg/L水合氯醛（300mg/kg）腹 腔注射麻醉大鼠后，迅速打開胸腔，經(jīng)心尖灌注后立即取胸主動(dòng)脈約12cm放入40g/L多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，而后切片（5卩m）行Masson染色。Masson切片中測(cè)量膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF,為膠原面積與動(dòng)脈總面積的比值）,每個(gè)標(biāo)本隨即選取23個(gè) 視野測(cè)分別取平均值作為各部位的測(cè)量值。1 2 4免疫組化法檢測(cè)主動(dòng)脈TGF3 1表達(dá)石蠟切片脫蠟；水化后加30mL/L過(guò)氧化氫，室溫孵育20min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，P

11、BS沖洗;熱修復(fù)抗原;WOmL/L正常山羊血清室溫孵育10min,消除背景染色;加 入適量一抗，工作濃度1 ： 100, 4C過(guò)夜，PBS洗;加生 物素標(biāo)記的二抗（生物素化山羊抗兔IgG抗體）37C孵育20min, PBS洗；加辣根酶標(biāo)顯色，封片。胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為陽(yáng)性，用Image Pro擬.Plus 6,0積分吸光度值（IA）,取5個(gè)視野的平均值作為該切片的值。1 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（士S）表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。組間比較采用多因素方差分析記的鏈酶卵白素工作液孵育37C 30min, PBS洗;DAB(Multi擬factor analysis

12、of varianee)。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。K23西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）K33第31卷4期K2I衛(wèi) 娜，牟建軍，王寶莉，等鹽負(fù)荷對(duì)自發(fā)性高血壓 大鼠胸主動(dòng)脈膠原含量及TGF3 1表達(dá)的影響2結(jié)果2.1尿量與尿鈉的變化基線時(shí)兩組大鼠尿量、尿鈉排泄無(wú)差異，實(shí)驗(yàn)第4、&12、16周，高鹽組24h尿量及尿鈉排泄均高于低鹽組（表1） O表1兩組SHR實(shí)驗(yàn)各階段尿量、尿鈉的比較與對(duì)照組比較，PO.05, P0.01。2 2實(shí)驗(yàn)各階段血壓的變化多因素方差分析顯示高鹽、年齡均對(duì)血壓變化有影響（P0.01）,高鹽飲食組SHR大鼠的SBP在4、&12、16周等各階段收縮壓均高于對(duì)

13、照組（P0.05,表2）。表2SHR實(shí)驗(yàn)各階段收縮壓的比較與對(duì)照組比較,*P0,05, *P0,01o2.3主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果2.3.1鹽對(duì)SHR胸主動(dòng)脈管壁膠原的影響隨周齡增加兩組大鼠的主動(dòng)脈管壁CVF逐漸增多；實(shí)驗(yàn)第4、&12、16周，與對(duì)照組比較,高鹽組大鼠主動(dòng)脈CVF增高（P0.05,圖2 3 2鹽對(duì)SHF胸主動(dòng)脈TGF3 1表達(dá)的影響 隨周齡增加兩組大 鼠的主動(dòng)脈TGF （3 1表達(dá)逐漸增多，至16周時(shí)TGF （3 1表達(dá)又開始降低。高鹽組與對(duì)照組TGF3 1的表達(dá)隨著周齡趨勢(shì)一致（圖2、表4）。多因素方差分析顯示高鹽、年齡均對(duì)TGFp 1表達(dá)水平有影響(P0.05)

14、;高鹽組的大鼠在實(shí)驗(yàn)第4、8 12周各階段TGF(3 1的表達(dá)均 較對(duì) 照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,表4)。A: 0周時(shí)對(duì)照組;B: 8周時(shí)對(duì)照組;C : 16周時(shí)對(duì)照組；D: 0周時(shí)高鹽組;E : 8周時(shí)高鹽組;F : 16周時(shí)高鹽組。染色結(jié)果顯示膠原纖維 呈對(duì)照組;B : 8周時(shí)對(duì)照組;C; 16周時(shí)對(duì)照組：D:0周時(shí)高鹽組;E: 8周時(shí)高鹽組;F : 16周時(shí)高鹽組。圖中的棕黃色顆粒為TGF(3 1表達(dá)。表3實(shí)驗(yàn)各階段SHF大鼠CVF的比較與對(duì)照組比較，*P0.01o表4各 組SHF大鼠胸主動(dòng)脈壁TGF3 1的吸光度值與對(duì)照組比較，*P0,01o3討論近年來(lái)，對(duì)高血壓的認(rèn)識(shí)從

15、阻力動(dòng)脈轉(zhuǎn)向?qū)Υ髣?dòng)脈的重視。研究表明大動(dòng)脈順應(yīng)性的降低是高血壓發(fā)生發(fā)展和各種并發(fā)癥發(fā)生的重要原因3。大動(dòng)脈順應(yīng)性降低的主要原因是動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)的變化，包 括血管平滑肌細(xì)胞增殖，膠原增生，彈性纖維減少或斷裂，導(dǎo)致大動(dòng)脈僵硬度增 加，彈性降低等。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分，除了作 為血管壁的支撐 材料外，還可以影響血管壁的組織形態(tài)。鹽與心血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切。高鹽攝入不僅導(dǎo)致血壓升高，而且有獨(dú)立于血壓之外的多重作用，可直接導(dǎo)致組織器官損傷，如左 室肥 厚、腎功能損害、腦卒中、血管硬化等4擬.5 0本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)第4、8 12、16周時(shí)，與正常鹽組比較高鹽組主動(dòng)脈CVF增藍(lán)色，平滑肌細(xì)胞及彈

16、性纖維呈紅色，胞核為深紅色。A: 0周時(shí)加，提示鹽可通過(guò)增加大動(dòng)脈的膠原含量從而降低其順應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)也顯示，適量低鹽飲食可以降低血壓、尿蛋白及動(dòng)脈僵硬度6。SIMON等7的研究發(fā)現(xiàn)，高鹽攝入在不影響血壓的情況下能使大動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)和血管壁性能發(fā)生改變，并認(rèn)為鹽能獨(dú)立于血壓對(duì)大動(dòng)脈血管壁 結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。AVOLIO等人調(diào)查了年齡、血壓匹配的血 壓正常人 在低鹽和正常鹽飲食不同狀態(tài)下的脈搏波傳導(dǎo)速度后發(fā)現(xiàn)，低鹽組的主動(dòng)脈、上下肢的脈搏波傳導(dǎo)速度明顯低于正常鹽飲食組。這個(gè)研究證實(shí)血壓8擬9研究證明，給高血壓患者及高血壓大鼠增加鈉攝入量時(shí)多伴有大動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能的改變。這種改變涉及到細(xì)胞外基質(zhì)，但與血壓

17、及動(dòng)脈 粥樣硬化無(wú)關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果也顯示，高鹽攝入可以使動(dòng)脈彈 性降低，鹽對(duì)大動(dòng)脈動(dòng)脈壁的功能影響早于小動(dòng)脈。鹽通過(guò)什么機(jī)制作用于動(dòng)脈壁，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈彈性降低，目前尚不清楚。近年來(lái)，隨著對(duì)TGF以B的深入研究，發(fā)現(xiàn)它對(duì)血管平滑肌 細(xì)胞(VSMC增殖、成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)沉積以及介導(dǎo)心血管疾病的發(fā)生起著重要作用。新近研究發(fā)現(xiàn)在眾多細(xì)胞生長(zhǎng)因子中，TGF以B1基因變異與高血壓及其靶器官損害的關(guān)系非常密切10。有研究發(fā)達(dá)明顯增高。TGFHB1增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)合成并誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞 肥 大、成纖維細(xì)胞增生和成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)中高鹽組的大鼠在實(shí)驗(yàn)第4、8 12周時(shí)

18、TGF (3 1的表達(dá)均較正人群正常人低鹽飲食時(shí)大動(dòng)脈的僵硬度較低。SAFER?現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠在心室重塑過(guò)程中TGF) : B1蛋白表常組增高， 提示鹽促進(jìn)主動(dòng)脈膠原增加以及加重動(dòng)脈重構(gòu)可能部分是 通過(guò) 增加TGF3 1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，TGF3 1在高鹽組與正常組的表達(dá)趨勢(shì)一致： 第0周時(shí)表達(dá)較少， 第4周時(shí)表達(dá)增多, 第8周時(shí)TGF(31的表達(dá)最多，而第12、16周時(shí)TGF3 1表達(dá)又逐漸降低，分析原因可能與實(shí)驗(yàn)后期主動(dòng)脈管壁的細(xì)胞外基質(zhì)增加而內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等合成TGF3 1的物質(zhì)減少有關(guān)。這也提示主動(dòng)脈重構(gòu)年齡等也是影響動(dòng)脈膠原含量及重構(gòu)的重要原因。本實(shí)驗(yàn)研

19、究結(jié)果提示高鹽攝入不僅可使血壓升高，還可通過(guò)影響TGF以B 1的含量進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈僵硬。所以，更應(yīng)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)限鹽的 重 要性，提倡及早開展以限鹽為中心的高血壓一級(jí)預(yù)防?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】DUMLERF. Dietarysodium in take and arterial blood pressure J, J Ren Nutr, 2009, 19(1):57擬60.2 NIJDAM ME, Plantinga Y, Hulsen HT, et al. Pulsepressure amplificationand risk of cardiovascular disease J,Am J Hypert

20、e ns, 2008, 21 (4):388擬392,并不完全是通過(guò)由鹽引起的TGF(3 1的增加而引起，血壓及13CHOBANIANAV, BAKRIS GL, BLACK HR, et al. The seventh report of the joi nt n ati onal committee on preve nti on, detect! on, evaluation, and treatme nt of high blood pressure: the JNC 7Report J, JAMA, 2003, 289(19):2560擬2572.4石蕊，李玉明，龐偉，等復(fù)合離子鹽對(duì)高血壓大鼠腎臟功能及結(jié)構(gòu)的影響J高血壓雜志，2006, 14(7):543擬545. 黃燕，汪家瑞，朱文玲，等高鹽飲食對(duì)大鼠左室肥厚的影響J高血壓雜志，2004, 12(3):242擬244. HE FJ, MARCINIAK M, VISAGIE E, et al. Effect ofmodest salt reduction on blood pressure, urinary albumin, andpulse wave velocity in white, black, hyperte nsives J.Hyperte nsio n, 2009, 54(3) :482