白細(xì)胞介素6單克隆抗體的研制

1、    白細(xì)胞介素6單克隆抗體的研制        摘要采用純化的工程菌表達(dá)產(chǎn)物白細(xì)胞介素6（Interleukin6，IL-6）免疫BALBC小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（SP20）在PEG作用下進(jìn)行融合，通過(guò)ELISA篩選并多次亞克隆，獲得了1株能分泌抗IL-6單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞Ic-1345。Westernblot顯示：抗體結(jié)合抗原的分子量與IL-6相符，為特異性抗IL-6抗體。亞類(lèi)鑒定表明：該細(xì)胞分泌的單克隆抗體為IgG1亞類(lèi)，kappa型。染色體數(shù)目為100條

2、左右。腹水效價(jià)為1104，無(wú)血清培養(yǎng)液效價(jià)為1102。此雜交瘤細(xì)胞株體外傳代培養(yǎng)6個(gè)月以上，ELISA檢測(cè)抗體滴度無(wú)明顯降低。關(guān)鍵詞IL-6單克隆抗體雜交瘤中號(hào)R392.11 THE PREPARATION AND PRELIMINARY DETERMINATION OF ANTI-IL-6 MONOCLONAL ANTIBODYChen Lin，Xu Xiuying，Bian Jiang，Yu Fang，Huang Peitang（Institute of Biotechnology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071）Ab

3、stract Balbc mice were immunized with interleukin 6（IL-6）antigen purified from engineered Ecoli strain，their spleen cells were fused with myeloma cells by polyethyleneglyco（PEG）After making ELISA screening and subcloning we obtained one positive hybridoma cell strain Ic-1345Western blot demonstrated

4、 that antibody was peculiar to combine with IL-6 antigenThe monoclonal antibody was IgG1 subclass，kappa typeChromosomal numbers were 100 or soWe cultivated and frozen cells，prepared ascetic fluid and serum-free supernatantThe titer of ascetic fluid was 1104 and serum-free supernatant was 1102The hyb

5、ridoma cell was bequeathed more than six months and the  titer of antibody had not obviously changedKey words Interleukin 6，Monoclonal antibody，Hybridoma白細(xì)胞介素6（IL-6）主要是由單核-吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，有多種生物學(xué)活性功能的細(xì)胞因子。它具有誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化增殖、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答、促進(jìn)造血細(xì)胞的分化和抗腫瘤的特性。臨床一些疾病的發(fā)生和發(fā)展與IL-6有密切關(guān)系1。文獻(xiàn)報(bào)道，臨床上許多疾病患者體液中IL-6水平有所提高23。目前國(guó)內(nèi)對(duì)

6、IL-6的研究已比較深入，尤其在IL-6基因重組表達(dá)方面進(jìn)展很快。IL-6抗體的研制為IL-6的檢測(cè)、鑒定、純化提供了方便。本文用PEG作為融合劑，使骨髓瘤細(xì)胞（SP20）與免疫的脾細(xì)胞融合，獲得了1株分泌抗IL-6單抗的雜交瘤細(xì)胞Ic-1345。我們將細(xì)胞凍存，同時(shí)制備細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)上清及小鼠腹水，并對(duì)該單抗進(jìn)行了亞類(lèi)鑒定及特異性鑒定。1 材料與方法1.1 材料PEG 4000：Serva產(chǎn)品；小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP20）：本組保存；IL-6抗原：為表達(dá)人重組白細(xì)胞介素6的大腸桿菌發(fā)酵、純化產(chǎn)品4；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG：Promega產(chǎn)品；BALBC小鼠：812周齡，雌性，按二級(jí)動(dòng)

7、物喂養(yǎng)，由本院動(dòng)物中心提供；RPMI 1640干粉：GIBCO產(chǎn)品；無(wú)支原體小牛血清：浙江杭州四季青生物工程材料研究所生產(chǎn)；儀器：細(xì)胞培養(yǎng)成套儀器，SS-3000酶聯(lián)儀，電泳儀，電轉(zhuǎn)移裝置。1.2 方法 動(dòng)物免疫：將200gIL-6抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，充分乳化，經(jīng)腹腔注射免疫BALBC小鼠。加強(qiáng)免疫則采用抗原與福氏不完全佐劑的乳化液。融合前3d，經(jīng)尾靜脈注射同等劑量的抗原生理鹽水溶液。1.2.2 融合 制備BALBC小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞。 將小鼠脾細(xì)胞與SP20細(xì)胞按51比例混合于50ml尖底離心管中，置于37°C水浴中，于45s內(nèi)緩慢滴入1ml 50PEG，靜置

8、1min，用GKN終止，離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸于含HAT的選擇培養(yǎng)基中，接種于96孔培養(yǎng)板中。1.2.3 ELISA檢測(cè)：采用間接ELISA法篩選分泌抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。1.2.4 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的亞克?。翰捎糜邢尴♂尫ㄟM(jìn)行。1.2.5 細(xì)胞凍存：按常規(guī)法進(jìn)行。1.2.6 雜交瘤細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液及腹水制備：1.2.6.1 通過(guò)亞克隆獲得的單克隆雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞瓶中長(zhǎng)滿(mǎn)單層后，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗1次，再加入無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，3d后收上清。 小鼠腹腔接種福氏不完全佐劑0.30.4ml只，714d后，經(jīng)腹腔接種105106雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部膨大，抽取腹水，20°C保存。1.2.7 抗體特

9、異性鑒定5：抗原經(jīng)SDS-PAGE后，通過(guò)電轉(zhuǎn)移裝置將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將膜浸泡于雜交瘤細(xì)胞上清中，再加入酶標(biāo)二抗作用底物DAB顯色。同時(shí)以抗原與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品電泳、考馬斯亮藍(lán)染色后脫色結(jié)果為對(duì)照。 亞類(lèi)鑒定：采用ELISA酶標(biāo)抗體法鑒定。1.2.9 染色體檢查：在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為0.3gml的秋水仙素，于37°C繼續(xù)培養(yǎng)2h，收集細(xì)胞，加0.075molL KCl，37°C保溫30min。用甲醇與冰醋酸混合液（兩者比例為31）固定3次，制片，Giemsa染色。2 結(jié)果與討論2.1 融合率 計(jì)數(shù)生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞的孔數(shù)，計(jì)算其與接種雜交瘤細(xì)胞的孔數(shù)之比，獲得融合

10、率為4。融合過(guò)程中，滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的優(yōu)劣、融合的時(shí)間、PEG的分子量及其pH等多種因素均影響細(xì)胞的融合效率。2.2 陽(yáng)性率 經(jīng)多次測(cè)定雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性率為19。2.3 ELISA檢測(cè)3次亞克隆的雜交瘤細(xì)胞上清 陽(yáng)性率達(dá)100（見(jiàn)1）。1雜交瘤細(xì)胞3次亞克隆后ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig 1The ELISA results of hybridoma cell subclone for three times1：A2：Blank； 2：B2：Negative control； 3The rest：Sample2.4 測(cè)定抗IL-6單克隆抗體效價(jià) 將雜交瘤細(xì)胞接種于預(yù)先致敏的小鼠腹腔，獲得腹水并用EL

11、ISA測(cè)定抗體效價(jià)為1104。2.4.2 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)3d，收上清測(cè)定抗體效價(jià)結(jié)果為1102。2.4.3 該雜交瘤細(xì)胞3d傳一代，體外傳代培養(yǎng)6個(gè)月以上，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)無(wú)明顯降低。 Western blot結(jié)果表明，抗體能與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的抗原結(jié)合，通過(guò)酶標(biāo)二抗作用后使底物顯色，其結(jié)合抗原的分子量與工程菌表達(dá)的IL-6分子量一致，證明該細(xì)胞分泌的單抗能與IL-6結(jié)合（見(jiàn)2）。2 Western blot結(jié)果Fig 2 The results of Western blot1：IL-6； 2：Reduced IL-6； 3：Molecular weight standard

12、：97400 66200 42700 31000 14400； 4：The result of Western blot for IL-6；5：The result of Western blot for reduced IL-62.6 抗體亞類(lèi)及型的鑒定 用ELISA法鑒定抗體為IgG1亞類(lèi)、kappa型。2.7 染色體檢查結(jié)果 染色體條數(shù)為100條左右，雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)為脾細(xì)胞與SP20細(xì)胞染色體數(shù)目之和，表明它們是融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞（見(jiàn)3）。3 雜交瘤細(xì)胞染色體Fig 3 The chromosomal morphology of hybridoma cellIL-6是機(jī)體內(nèi)具有多種

13、調(diào)節(jié)功能的因子。體內(nèi)IL-6水平的異常變化與多種疾病有關(guān)。采用細(xì)胞生物活性法6測(cè)定體液及工程菌表達(dá)的IL-6水平工作量大且費(fèi)用高。我們用傳統(tǒng)的細(xì)胞融合技術(shù)7，通過(guò)亞克隆、篩選獲得了1株分泌抗IL-6單抗的雜交瘤細(xì)胞?？贵w亞類(lèi)鑒定為IgG1。IL-6單抗制備成功為臨床和基礎(chǔ)相關(guān)研究提供了方便。作者單位:陳琳徐秀英邊疆于芳黃培堂軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所北京100071第一作者：陳琳，女，33歲，大專(zhuān)，實(shí)驗(yàn)師參考文獻(xiàn)1 Hirano T，Akira S，Taga T，et alBiological and clinical aspects of interleukin 6Immunol Toda

14、y，1990，11（12）：4432 Van Oers MHJ，Van Der Heyden AAPAM，Aarden LA，et alIL-6 in serum and urine of renal transplant reci-pientsC1in Exp Immunol，1988，71：3143  Honda M，Kitamura K，Mizutani Y，et alQantitative analysis of serum IL-6 and its correlation with increased levels of serum IL-2R in HIV-induced diseasesJ Immunol，1990，145（2）：40594 邊 疆，陶好霞，薛 沖，等.重組人白細(xì)胞介素6的制備.生物工程進(jìn)展，1995，15（6）；335 Towbin H，Staehelin T，Gordon JElectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets；procedure and some applicationsProc Nat1 Aca Sci USA，