母牛分支桿菌菌苗對(duì)結(jié)核病小鼠Th1Th2細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及誘導(dǎo)型一

1、    母牛分支桿菌菌苗對(duì)結(jié)核病小鼠Th1/Th2 細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 表達(dá)影響的研究        摘要：目的從分子病理學(xué)角度探討母牛分支桿菌菌苗（以下簡(jiǎn)稱母牛菌苗）的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法將BALB/C小鼠隨機(jī)分為3組：?jiǎn)渭児ザ窘M(A)、母牛菌苗免疫攻毒組(B)和正常對(duì)照組(N)。經(jīng)尾靜脈注射H37RV建立結(jié)核病小鼠模型，母牛菌苗由腹腔注射。肉眼觀察肺臟病變指數(shù)并采用免疫組化染色和常規(guī)HE染色,探討IFN-、IL-4、iNOS表達(dá)與肺臟組織損傷

2、的類型和程度的關(guān)系。結(jié)果結(jié)核病小鼠病變彌漫，伴有灶性干酪壞死，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示在炎性滲出及肉芽腫內(nèi)IFN-陽性細(xì)胞隨時(shí)間推移逐漸增多，至第6周達(dá)高峰（0.058±0.010），與正常對(duì)照組比較有非常顯著性差異（0.005±0.020，P<0.01）。此后為Tho平衡期，在肺損傷組織中IFN-和IL-4陽性細(xì)胞基本相當(dāng)。iNOS表達(dá)在急性期增多慢性期減少。母牛菌苗免疫攻毒組小鼠肺組織病變，以增殖結(jié)節(jié)、淋巴樣結(jié)節(jié)為主，未見壞死病變，免疫反應(yīng)表現(xiàn)為：感染全過程中以Th1應(yīng)答為主，即IFN-陽性細(xì)胞逐漸增多，第8周達(dá)高峰（0.058±0.010），IL-4陽

3、性細(xì)胞一直維持在低水平，未出現(xiàn)Tho平衡期。iNOS表達(dá)一直維持在高水平。結(jié)論母牛菌苗調(diào)節(jié)結(jié)核病小鼠免疫的可能機(jī)制為：?jiǎn)?dòng)Th1應(yīng)答，抑制Th2應(yīng)答，激活iNOS活性，增強(qiáng)機(jī)體保護(hù)性免疫。關(guān)鍵詞：結(jié)核；母牛分支桿菌菌苗；干擾素；白細(xì)胞介素4；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶Mycobacterium vaccae influences the kinetics of Th1/Th2 cells and expression of iNOS in a marine model of experimental tuberculosisZHANG Liqun(Beijing Chest Hospital, Bei

4、jing 100095, China)MA WeiluDA JipingAbstract：ObjectiveTo investigate the immunoregulative mechanism of Mycobacterium vaccae by way of molecular pathology. MethodsBALB/C mice were randomly divided into three groups: tuberculosis model (A); mice were challenged with H37RV by their tail veins and then

5、immunized by M. vaccae (B); control mice (N). Immunohistochemistry and pathological slices stained with HE were evaluated to investigate the correlation between the expression of IFN-,IL-4 and iNOS and the type and magnitude of tissue injury. ResultsA predominance of Th1 cells was observed manifeste

6、d by a high percentage of IFN- ，P<0.01). This was followed by a chronic advanced phase characterized by pneumonia local necrosis with a Tho balance due to an equivalent proportion of IFN- and IL-4 positive cells in the lung lesions. The iNOS expression was increased in acute phase and decreased i

7、n chronic phase. B group had localized lung lesions, proliferate and lymphoid nodules were predominant, there was less necrostic change. A predominance of Th1 cells was observed during the infection changed over time and there was no Tho balance phase occurred. iNOS expression had a higher level dur

8、ing the wholecourse of infection. ConclusionM.vaccae can enhance the protective immunological response by inducing Th1 response and inhibiting Th2 response.Key words：Tuberculosis；Mycobacterium vaccae；Interferon-；Interleukin-4；Inducible nitric oxide synthase隨著細(xì)胞免疫學(xué)、分子生物學(xué)的進(jìn)展，人們對(duì)結(jié)核病的認(rèn)識(shí)發(fā)生了深刻變化。研究表明：小鼠感染

9、結(jié)核分支桿菌后產(chǎn)生有效的抗菌免疫需要一系列T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞（M）的共同作用，包括T細(xì)胞抗原識(shí)別受體+及+T細(xì)胞，CD4和CD8T細(xì)胞的激活。同時(shí)，細(xì)胞因子尤其是干擾素-（IFN-）、腫瘤壞死因子-（TNF-）和白細(xì)胞介素4(IL-4）及活化M內(nèi)產(chǎn)生的活性氮中介物等也是抗菌免疫的關(guān)鍵1,2。多種細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)及其在結(jié)核病發(fā)病過程中的重要作用，為結(jié)核病免疫病理學(xué)及免疫治療學(xué)的深入研究開辟了新路3,4，有關(guān)結(jié)核病病理和免疫學(xué)相關(guān)性的深入、系統(tǒng)的分子病理學(xué)研究，尚需深入進(jìn)行。在治療措施方面，由于耐多藥結(jié)核病的不斷增多及藥物毒副作用等諸多因素，抗結(jié)核治療面臨巨大挑戰(zhàn)，結(jié)核病的免疫治療成為又一研究熱點(diǎn)

10、。母牛分支桿菌菌苗（以下稱母牛菌苗）是WHO在其90年代結(jié)核病研究與發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃中推薦的唯一免疫治療劑，10余年來我國學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了多方面的研究5-7，但母牛菌苗對(duì)Th1/Th2細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)與病理改變的相關(guān)性及對(duì)發(fā)病機(jī)制的影響尚未見報(bào)道。我們?cè)诮⑿∈蠼Y(jié)核病模型的基礎(chǔ)上，給予母牛菌苗免疫注射，采用免疫組織化學(xué)法觀察小鼠肺組織IFN-、IL-4及iNOS的定位和表達(dá)變化，旨在進(jìn)一步探討母牛菌苗的保護(hù)性免疫作用機(jī)制。材料與方法一、材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/C小鼠，雌雄各半，體重1820 g，購自衛(wèi)生部生物制品研究所。2. 抗體：抗鼠IFN-和IL-4單克隆抗體購

11、自晶美生物工程有限公司(美國Endogen公司產(chǎn))。抗iNOS多克隆抗體購自美國Santa Crus公司。3. 藥品：母牛菌苗由衛(wèi)生部生物制品檢定所饋贈(zèng)。4. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房：由北京結(jié)核病與胸部腫瘤研究所提供二級(jí)動(dòng)物房。5.主要生化試劑：免疫組織化學(xué)染色采用北京中山生物技術(shù)有限公司的SP試劑盒。6.CMIAS真彩色像分析系統(tǒng)由解放軍空軍總醫(yī)院提供。二、方法1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為以下3組：結(jié)核病模型組（24只，A），感染后母牛菌苗免疫組（24只，B）及正常對(duì)照組（24只，N）。2. 結(jié)核病小鼠模型的建立：取在改良羅氏培養(yǎng)基上生長良好的結(jié)核分支桿菌H37Rv 2周的培養(yǎng)物，用瑪瑙乳缽磨

12、成10 mg/3 ml的均勻菌懸液（含0.05吐溫80的滅菌生理鹽水溶液），用生理鹽水稀釋成1 mg/3 ml的菌懸液，于每只小鼠尾靜脈內(nèi)注射0.3 ml（相當(dāng)于濕菌0.1 mg/只），含菌量單位106/只。3. 母牛菌苗的給藥方法：于攻毒后10天腹腔內(nèi)注射母牛菌苗22.5 g只。4. 觀察指標(biāo)：(1) 肺部病變指數(shù)：肉眼觀察各組動(dòng)物肺臟結(jié)核病變范圍。無病變?yōu)?；結(jié)核病變偶見為±，指數(shù)為0.5；病變范圍全肺10為，指數(shù)為1；病變占全肺1024為，指數(shù)為2；病變占全肺2550為，指數(shù)為3；病變?nèi)?0為，指數(shù)為4。(2) 光鏡觀察：A、B組分別于攻毒后第2、4、6、8周脫頸處死。正常小

13、鼠同期處死，每次解剖6只小鼠。取出肺臟立即放入10中性甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋及切片，厚5 m，分別做HE染色及免疫組織化學(xué)染色。5.免疫組織化學(xué)染色方法：切片經(jīng)預(yù)處理后，順序滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體(IFN-、IL-4為1300，iNOS為1150),4過夜，生物素標(biāo)記的二抗工作液，37，30分鐘及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37，30分鐘。DAB-H2O2溶液顯色（110分鐘）， 終止顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果棕黃色為陽性顯色。6. 像分析：每只小鼠肺標(biāo)本取3張切片進(jìn)行3種抗體染色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用像分析系統(tǒng)分別測(cè)定（40×5視野下）單位

14、面積 IFN-、IL-4、iNOS陽性細(xì)胞的面積，用面密度表示。7. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：各指標(biāo)以±s表示，采用方差分析和直線相關(guān)分析。結(jié)果一、小鼠肺組織病理改變感染組小鼠感染后1個(gè)月，肺組織內(nèi)出現(xiàn)較多泡沫樣的M（M吞噬結(jié)核分支桿菌后形成）及淋巴細(xì)胞形成的炎癥區(qū)域，并有大量多核白細(xì)胞及蛋白滲出物。感染后2月，肺實(shí)質(zhì)內(nèi)廣泛肺炎區(qū)伴有灶性壞死和膽固醇結(jié)晶（為M吞噬結(jié)核分支桿菌后崩解所致，1），其內(nèi)有大量結(jié)核分支桿菌（抗酸染色所見）。1感染后8周小鼠肺組織病變，呈彌漫性病變，可見局灶性壞死和膽固醇結(jié)晶HE×100母牛菌苗免疫攻毒組小鼠感染后1個(gè)月，肺部病變局限化，結(jié)核性肉芽腫內(nèi)出現(xiàn)以上皮

15、樣細(xì)胞為主的增殖性結(jié)節(jié)及以淋巴細(xì)胞為主的淋巴樣細(xì)胞結(jié)節(jié)。感染2個(gè)月，肺部病灶進(jìn)一步局限化，結(jié)核結(jié)節(jié)更趨典型，未見灶性壞死(2)。2攻毒免疫后8周小鼠肺組織病變，可見淋巴細(xì)胞為主的淋巴細(xì)胞結(jié)節(jié)HE×100二、肺臟病變指數(shù)肉眼觀察兩組結(jié)核病變指數(shù)見表1。表1兩組小鼠肺臟病變指數(shù)組別動(dòng)物數(shù)病變指數(shù)P值單純攻毒組24攻毒母牛菌苗組24三、IFN-和IL-4免疫細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)及組織學(xué)定位正常小鼠肺組織內(nèi)可見少許IL-4、IFN-陽性細(xì)胞。感染小鼠在感染第2周IFN-陽性細(xì)胞開始增多，至第6周達(dá)高峰(3)。感染第2周IL-4陽性細(xì)胞已明顯增多，至第6周達(dá)高峰。感染后4周IFN-與IL-4陽性細(xì)胞面

16、密度基本相當(dāng)(4)。陽性細(xì)胞染色部位位于結(jié)核結(jié)節(jié)，肺間質(zhì)、血管周圍及支氣管周圍炎癥區(qū)內(nèi)，支氣管上皮亦有陽性著色，M呈陽性染色。 3感染6周肺組織IFN-陽性染色明顯增多免疫組化×4004感染6周肺組織IL-4陽性染色明顯增多免疫組化×400組間比較，母牛菌苗免疫組IFN-陽性細(xì)胞持續(xù)增多，病程中未出現(xiàn)IL-4與IFN-陽性細(xì)胞相當(dāng)?shù)臅r(shí)期(5，6)。像結(jié)果見表2和表3。表2病程中小鼠肺內(nèi)IFN-的變化（±s）組別 動(dòng)物數(shù) 第2周 第4周 第6周 第8周A 24 0.058±0.010 B 24 0.049±0.020 0.057±0.0

17、30 N24 *注：與第4、6、8周比較，P0.05；與A、B組比較*P0.01 表3病程中小鼠肺內(nèi)IL-4的變化（±s）組別 動(dòng)物數(shù) 第2周 第4周 第6周 第8周A 24 B 24*N 24*注：與第4、6、8周比較P0.05；與A、B組比較*P0.01；與A組比較*P0.05 5 攻毒免疫8周肺組織IFN-陽性染色明顯增多免疫組化×4006 攻毒免疫8周肺組織IL-4陽性染色較少免疫組化×400四、肺組織iNOS免疫組織化學(xué)染色結(jié)果正常對(duì)照小鼠支氣管上皮可見少量iNOS染色陽性細(xì)胞。單純攻毒組小鼠肺內(nèi)iNOS陽性細(xì)胞在感染后2周已有增多，至4周達(dá)高峰。但隨后

18、則減少，至第6周時(shí)降至最低(7)。母牛菌苗免疫攻毒組iNOS陽性細(xì)胞在感染后第2周增多，至4周達(dá)高峰，此后維持高水平(8)。像結(jié)果見表4。7感染6周肺組織iNOS陽性染色較少免疫組化×4008 攻毒免疫8周肺組織iNOS陽性染色較多免疫組化×400表4病程中小鼠肺內(nèi)iNOS的變化（±s）組別 動(dòng)物數(shù) 第2周 第4周 第6周 第8周A 24 0.011±0.010 0.011±0.010 B 24 *N 24*注：與第2、6、8周比較P0.05；與A、B組比較*P0.01；與A組比較*P0.05 五、IFN-、IL-4與iNOS的相關(guān)性iNOS與

19、IFN-/Il-4比值呈正相關(guān)，0.6224，P0.05。討論許多慢性感染性疾病，包括結(jié)核分支桿菌感染，CD4細(xì)胞在宿主免疫反應(yīng)中起重要作用。CD4細(xì)胞介導(dǎo)和調(diào)控著獲得性保護(hù)性細(xì)胞免疫反應(yīng)，但也參與感染的發(fā)生、慢性化及組織損傷。根據(jù)Th細(xì)胞所產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同可分為Th1和Th2兩種亞類細(xì)胞。Th1細(xì)胞分泌IFN-、IL-2和淋巴毒素（LT）等，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，如促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷作用，激活M殺滅細(xì)胞內(nèi)病原體等。Th2細(xì)胞分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等，主要功能為促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)育和介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,如促進(jìn)抗體的產(chǎn)生、抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、抑制單核-

20、巨噬細(xì)胞的激活和活性氧產(chǎn)物的產(chǎn)生等8。Tho細(xì)胞是Th1和Th2細(xì)胞的前體細(xì)胞，可以向這兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)化。一般認(rèn)為：Th1免疫應(yīng)答能增強(qiáng)宿主對(duì)微生物感染,尤其是病毒與細(xì)胞內(nèi)病原體的免疫性和防御功能,而Th2應(yīng)答則與感染的進(jìn)展、持續(xù)性和慢性化有關(guān),對(duì)微生物感染有負(fù)性調(diào)節(jié)作用9,10。在生物體內(nèi)，NO是由NO合酶（NOS）催化L-精氨酸胍基末端上氮氧化而成。NOS主要有兩種類型：基礎(chǔ)型NOS（consitive NOS ,cNOS）和誘導(dǎo)型NOS（induced NOS,iNOS）。研究表明，肺M中只有iNOS11，當(dāng)異物入侵或腫瘤發(fā)生時(shí)，M或腫瘤細(xì)胞可以在內(nèi)毒素和細(xì)胞因子作用下產(chǎn)生大量的NO，產(chǎn)生的

21、NO在宿主防御方面具有重要意義。體外實(shí)驗(yàn)證明，NO能介導(dǎo)活化M?抑制和殺傷微生物病原體12。Denis13報(bào)道用 IFN-激活小鼠M產(chǎn)生NO能有效地抑制其中的結(jié)核分支桿菌生長。Chan14報(bào)道活化的小鼠M產(chǎn)生的NO能有效殺死致病的結(jié)核分支桿菌。我們的研究結(jié)果表明：結(jié)核病小鼠肺組織IFN-IL-4比值與iNOS表達(dá)呈正相關(guān)。隨著病程的進(jìn)展，IFN-陽性細(xì)胞數(shù)的增多、iNOS表達(dá)亦增多，但隨著IL-4陽性細(xì)胞的增多、Tho平衡期的出現(xiàn)，iNOS陽性細(xì)胞數(shù)反見減少。研究證實(shí)，與NO產(chǎn)生有關(guān)的刺激性細(xì)胞因子（IFN-，TNF-和IL-1）與抑制性細(xì)胞因子（IL-4，IL-10，TGF-）的平衡在抗分支

22、桿菌免疫中起關(guān)鍵作用15。我們的研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)。說明NO是M內(nèi)抑制和殺傷結(jié)核分支桿菌的主要效應(yīng)分子，而iNOS的活性受到Th1與Th2型細(xì)胞因子的調(diào)控。研究表明，母牛分支桿菌制劑能刺激T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),加用rIL-2有明顯協(xié)調(diào)作用5，能激活M產(chǎn)生NO7與H2O26，從而達(dá)到殺菌的目的，與卡介苗及IFN-活化M產(chǎn)生NO的殺菌效果一致。本研究結(jié)果表明：母牛菌苗免疫攻毒組小鼠肺部病變以增殖性結(jié)核結(jié)節(jié)和淋巴樣結(jié)節(jié)為主，而滲出及壞死性病變輕；單純攻毒組小鼠病變彌漫，出現(xiàn)灶性干酪性壞死。另外，實(shí)驗(yàn)中還觀察到單純攻毒與攻毒免疫組小鼠肺組織IFN-陽性細(xì)胞數(shù)均多，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但前組IFN-陽

23、性細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的時(shí)間長，病程中表現(xiàn)為Th1應(yīng)答，至少到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)Th0平衡期；后組在慢性期表現(xiàn)為Th0平衡。兩組iNOS的表達(dá)也不相同。攻毒免疫組小鼠iNOS表達(dá)持續(xù)增高，病程中一直維持高水平；而單純攻毒組iNOS的表達(dá)在急性期增高，慢性期反見下降。由此可見，母牛菌苗有保護(hù)性免疫調(diào)節(jié)作用，其進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制很可能是：?jiǎn)?dòng)Th1應(yīng)答，誘導(dǎo)IFN-的產(chǎn)生及iNOS的表達(dá)，抑制Th2應(yīng)答，激活M產(chǎn)生NO，從而抑制或殺死結(jié)核分支桿菌。志謝感謝北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所段連山主任等的大力支持作者單位：張立群(北京胸科醫(yī)院100095)馬偉路(北京胸科醫(yī)院100095)笪冀平(解放軍空軍總醫(yī)院)王保

24、法(河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)參考文獻(xiàn)：1Kaufmann SHE. Bacterial and protozoal infections in genetically disrupted mice. Curr Opin Immunol, 1994, 6:518-525.2Kumararatne DS. Tuberculosis and immunodeficiency of mice and men. Clin Exp Immunol, 1997, 107:11-14.3譚明旗.結(jié)核性胸膜炎患者血清及胸水可溶性IL-2受體的研究.中國免疫學(xué)雜志，1997,2:127-128.4萬獻(xiàn)堯，畢麗巖

25、.結(jié)核性胸膜炎與細(xì)胞因子. 日本醫(yī)學(xué)介紹，1998，19:26.5莊玉輝，李小明，李國利,等.母牛分支桿菌制劑對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)影響的研究.微生物學(xué)報(bào)，1995，35:292-294.6李曉明，王國治，趙桂芳,等.母牛分支桿菌制劑對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過氧化氫水平的影響.中國防癆雜志，1996，18：21-22.7王國治，趙桂芳，李曉明,等.母牛分支桿菌通過一氧化氮進(jìn)行免疫調(diào)節(jié).中華結(jié)核和呼吸雜志，1996，19:140-142.8Fan XG, Yakoob J, Fan XJ, et al.Enhanced T-helper 2 lymphocyte responses immune mechanisms of Helicobacter pylori infection