海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究

1、中國海洋大學博士學位論文海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究 姓名:呂志華申請學位級別:博士專業(yè):水產(chǎn)品加工與貯藏工程指導教師:劉昌孝20080601海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究 摘要海洋硫酸多糖PS916是以來源于海洋的甲殼質(zhì)為基礎原料,經(jīng)多步分子修飾 而得到的一種硫酸氨基多糖,化學名為13-(1,4一3.氧.硫酸基一6一氧一硫酸基一6一氧一羧 甲基醚鈉鹽,英文名為p一(1,4polyglycosamine一3-O-sulfate6O sulfate一6一Ocarboxylmethyl ethersodiu

2、m,藥效學研究結(jié)果表明PS916具有調(diào)血脂、抗脂質(zhì)過 氧化、抑制血管平滑肌細胞增殖等作用,具有多途徑抗動脈粥樣硬化作用,系正 在進行系統(tǒng)研究的I類新藥。本文對PS916在大鼠體內(nèi)的藥代動力學、組織分布 及排泄進行了研究,初步闡明了PS916在大鼠體內(nèi)的吸收,分布及排泄過程,為 新藥開發(fā)和臨床用藥提供了一定的理論依據(jù)。本論文主要研究工作如下:一、PS916的熒光標記研究PS916為多糖類物質(zhì),在分子結(jié)構(gòu)中缺乏發(fā)色團和熒光團,不能直接用紫外 或熒光法進行檢測,質(zhì)譜法也不適合多糖的定量分析。因此,我們以異硫氰酸熒 光素(FITC為熒光標記試劑,對PS916進行了熒光標記,標記后的PS916的熒光 最

3、大激發(fā)波長EX為480nm,最大發(fā)射波長Em為515nm;熒光標記的PS916中含 FITC 0.74%;以高效凝膠色譜法測定PS916分子量及分子量分布,測定結(jié)果表 明,標記后的PS916平均分子量及分子量分布寬度與標記前比較均未發(fā)生顯著變 化。二、PS916的體內(nèi)外穩(wěn)定性研究以熒光標記的PS916為研究對象,采用高效凝膠色譜法考察PS916在磷酸 鹽緩沖液(PBS及大鼠血漿中的穩(wěn)定性。PS916體外在PBS、大鼠血漿及大鼠 尿液中37"C孵育lh、2011,其分子量及分子量分布寬度均未發(fā)生變化,熒光強度 也未發(fā)生變化,表明PS916體外在PBS、大鼠血漿及大鼠尿液中穩(wěn)定。同時,

4、對大鼠以口服和靜脈注射兩種給藥方式給藥后PS916在血漿、尿液和糞便中的穩(wěn) 定性進行了研究,體內(nèi)大鼠口服PS916后血漿和糞便中PS916均以原型形式存在; PS916靜脈注射給藥后尿液中以原型形式從尿液中排泄,說明大鼠口服和靜脈注海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究射PS916后,主要以原型的形式吸收代謝。三、PS916在生物樣品中的定量分析方法研究建立了生物樣品中PS916的熒光定量分析方法,PS916的血漿濃度在O.220 pg/mL的濃度范圍內(nèi)PS916的熒光強度與濃度具有良好的線性關(guān)系,線性方程為: Y=22.951x一3.3561,相關(guān)系數(shù)r2=o.9991,血漿中P

5、S916最低定量限為0.2pg/mL; 低、中、高(0.2、2.0、20.O“g/mL3種濃度的日內(nèi)精密度在1.527.83%之 間,日間精密度在2.148.42%之間,組內(nèi)回收率在84.3108.O%之間,組間回 收率在88.7-100.1%之間;血漿樣品穩(wěn)定性考察顯示PS916在-70。C條件下放置4周相對穩(wěn)定。PS916在組織、尿液及糞便中的線性、精密度、準確度及穩(wěn)定性分 析均符合生物樣品體內(nèi)定量分析的要求。證明本實驗方法適用于PS916在大鼠血 漿、組織等生物樣品中含量的測定。四、PS916在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究1、大鼠口服和靜脈給藥PS916后,血藥濃度一時間曲線數(shù)據(jù)采用非房室模

6、 型計算藥代動力學參數(shù),通過餳緞和AI_/C與給藥劑量的相關(guān)性分析結(jié)果表明, 大鼠口服和靜脈給藥后,PS916在大鼠體內(nèi)呈線性動力學特征。2、大鼠口服PS916后,三種劑量的平均Tmax為3.28士0.58h,可知PS916在大鼠體內(nèi)吸收較慢,達峰遲緩。大鼠口服三種劑量下平均消除半衰期0/2為7.84 4-0.12h,大鼠靜脈注射三種劑量下平均消除半衰期鋤為8.744-1.Olh,口服和靜 脈給藥后的fJ尼無統(tǒng)計學差異(P>O.05,PS916在大鼠體內(nèi)的半衰期較長, 3、大鼠口服和靜脈給藥后,用么計算PS916絕對生物利用度為9.06%,顯示大鼠口服PS916吸收較差,生物利用度較低。

7、4、在大鼠連續(xù)給藥實驗中,口服50mg/kg劑量PS916多次給藥與單次給藥 相比,藥.時曲線基本吻合,首、末次給藥后的f,力和么值均無統(tǒng)計學差異,提示PS916多次給藥體內(nèi)不易蓄積,且對其代謝酶無誘導抑制作用。5、大鼠單次口服PS916后,組織分布實驗表明,給藥后1h,藥物能分布到 大部分組織中,在腸和胃中分布最高,另外主要分布在血流充足的肝和肺組織; 給藥6h后,腸和胃組織中藥物濃度明顯下降,腎臟中藥物濃度明顯升高,表明 PS916吸收入血后的藥物主要經(jīng)腎臟隨尿液排出:給藥24h后,大部分組織中藥 2物濃度均明顯降低。給藥后腦組織中可檢測到藥物,說明PS916能透過血腦屏障, 向腦內(nèi)分布。

8、6、大鼠單次靜脈給予PS916后,組織分布實驗表明,PS916靜脈給藥后在 大鼠各主要組織中廣泛分布。給藥后lh,PS916在大鼠腎臟、肝臟、血漿中的濃 度較高,在腎臟中濃度最高,在腸中亦有相對較高濃度,在腎臟中含量高說明該 藥物主要經(jīng)腎排泄。PS916靜脈注射6h后,腎臟中藥物濃度在3個時間點中最 高,在腎臟、肝臟、腸、心、肺、胃、脾等組織中的濃度均大于其血漿濃度,說 明、PS916的組織分布比例較大。給藥后PS916在腦中亦可檢出,說明PS916能 透過血腦屏障,向腦內(nèi)分布。7、大鼠口服給予PS916后,主要以原型從糞便和尿液中排出體外,給藥72h 后,尿中PS916的累積排泄量占給藥劑量

9、百分比為1.2884-0.958%;糞中PS916的累積排泄量占給藥劑量百分比為78.9744-5.498%;灌胃給藥后72h內(nèi),有相當 于給藥量80.26%的藥物以原型的形式隨尿糞排出體外,灌胃給藥后PS916主要 是從糞便中排出。8、大鼠靜脈注射給予PS916后,主要以原型從糞便和尿液中排出體外,給 藥72h后,尿中PS916的累積排泄量占劑量百分比為54.388士11.832%;糞中PS916的累積排泄量占劑量百分比為6.2864-1.938%;靜脈注射給藥后72h內(nèi),有相當 于給藥量60.67%的藥物以原型的形式隨尿糞排出體外,靜脈給藥后PS916主要 是從尿液中排出體外。關(guān)鍵詞:海洋

10、多糖藥物PS916;熒光標記;藥代動力學STUD I ES 0N FLUORESCENT LABEL I NG AND PHARMACOK I NET l CS 0F MAR I NE SULFATED POLYSACCHAR I DE PS916AbstractPS916is a new form of sulfated amino polysaccharide that is derived from marine chitin and by ways of molecular modifications.It is characterized by 1,4-1inked pD-gluco

11、samine vvitll an average of 1.0sulfate and 0.5carboxylmethyl groups per unit monosaccharide.The average molecular weight of PS916is 7000Da and the distribution width of molecular weight is less than 1.5.Systematic pharrnacodynamic research shows that PS916has good antiatherosclerotic activity and Wa

12、s authorized to enter clinical trial in China.T11is paper was designed to evaluate the pharmacokinetics features of PS916in rats to provid scientific data for the new drug development and clinic use.1.The fluroeescent labeling of PS916PS916,similar to other polysaccharides such as glucosan,possesses

13、 few chromophoric or fluorophoric structurally,SO derect detection is impossible、i廿l violet-visible(uvVisor flurocescence method,Mass spectra method is unsuitable to quantification analysis of polysaccharides either.Fluoresceinisothiocyanate(FITC is a fluroscent labeling regent usually used to label

14、 protein,SO we chose it to label PS916because just like protein there is amino group in its structure.UVVis and flurocescence spectroscopy demonstrated the labeling of FITC to PS916.The maxium excition wavelength of labeled PS916is 480nm,and the maxium emission wavelength is 515nm.Furthermore,labele

15、d PS916was determined spectrophotometrically by visible absorption at 490nm with reference to FITC,the content of FITC in labeled PS916was 0.71%(w/w.The molecular weight of labeled PS916WaS examined by hi曲performance gel permeation chromatography(HPGPC. The average molecular weight and the distribut

16、ion width of molecular weight of 5海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究labeled PS916were not signifficent different from that of unlabeled PS916.2.The stability of PS916in vitro and in vivoThe stability of PS916in vitro and in vivo was investigated using HPGPC method 謝t11fluorescesent labeled PS916.After l,20h

17、incubation inphosphate buffer,rat plasma and rat urine at 37。C,the molecular weight and the width of molecular weight distribution were not changed,that showed PS916Was stable in vitro.After oral administration of PS916to rats,PS916was in its original form in rat plasma and rat feces,meanwhile after

18、 all intravenous administration of PS916to rats,PS916Was also excreted in its original form in rat urine,that demonstrated PS916metabolized in its original form.3.The establishment of analyileal method of PS916in biological matrixA rapid,sensitive fluroescence method Was developed to determine PS916

19、in biological matrix.11le linear calibration curve was obtained in the range of 0.2-20 rtg/mL in rat plasma.The lower limit of quantitation(LLOQwas 0.21xg/mL.The inter-day CV%at 0.2,2.0and 20I.tg/mL of PS916Was 6.35%,3.81%and 1.68%, respecttively.The intra-day CV%at the above concentrations Was 8.42

20、%,4.38%and 2.14%,respectively.Oneway analysis of variance(ANOVAWas carried out witll grouping variable“day”to assess precision at 95%level.The result Was non-significant when data for each day was compared with other days and within the same day.The calibration curves were also linear in other biolo

21、gical sample such as tiusse,urine and feces,range winl correlation coefficient all above O.99.The established method is suitable for PS916pharmacokinetics studies.4.The pharmaeokinetics study of PS916Individual plasma-concentration data were analyzed by noncompartmental in this paperAfter intravenou

22、s and oral administration of PS916to rats,the proportionality between dosage and G懈or A UC was calculated,A good correlation Was found 6. 海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究between the dosage and AUc and C懈,PS916exhibited doseproportionalpharmacokinetics、vith linear kinetic character.Following oral administra

23、tion,theaverageof three dosages was 3.284-0.58h, that means the absorption of PS916was slowly.After intravenous and oraladministration,the averagetv2were 7.844-O.12h and 8.744-1.01h,respectively, PS916had a long terminal half-life.The absolute oral bioavailability of PS916was 9.06%,which was calcula

24、ted by compared the Aof oral administration to the Aof intravenous administration at the dose of 25mg/kg.The bioavailability of PS916was low.After multiple dosage of PS916at 50mg/kg,the plasma concentration-time profile was basically the same as that of signal dosage,t/n and A UCwere nonsignificant

25、between thefirst and the last dosage,that mean PS916Was not accumulated in rats. PS916Was widely distributed to tissues of most organs in rats lh after oral administration of PS916,such as stomach,intestine,liver,kidneys,lung and heart. The concentration in stomach and intestine was the most highest

26、 in all tissues,the concentration in lung and liver Was higher than other tissues.The concentration in stomach and intestine degraded rapidly,and increased rapidly in kidney 6h after oral administration of PS916,that show PS916Was excreted mainly by kidney after absorption.For all tissues,PS916conce

27、ntrations had significantly decreased at the time point of 24h after oral administration.PS916was also be detected in brain,that mean PS916COuld also across blood.brain barrierPS916was widely distributed to tissues of most organs in rats lh afterintravenous administration of PS916,suchas liver,kidne

28、ys,lung,heart and intestine.The concentration in kidney,liver and plasma Was higher,the most highest in kidney,that show PS916Was excreted mainly by kidney.The concentration in most tissues such as liver,kidney,lung,heart,spleen and intestine Was higher than that of plasma,that meanPS916Was widely d

29、istributed tO tissues.PS916was also be detected in brain, that mean PS916could also across blood.brain barrier. 7海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究PS916was mainly excreted in its original form from feces and urine after oral administration.Cumulative amounts percentage of PS916in feces at 72h after all oral

30、dose was 78.9744-5.498%.Cumulative amounts percentage of PS916in urine at 72h after an oral dose was 1.2884-0.958%.Drug which Was excreted totally in urine and feces in 72h after an oral administration of PS916was equal to 80.26%of given dose. PS916Was mainly excreted from feces after oral administr

31、ation.PS916Was mainly excreted in its original form from feces and urine after oral administration.Cumulative amounts percentage of PS916in urine at 72h after an oraldose Was 54.388士1 1.832%.Cumulative amountspercentage of PS916in feces at 72h after an oral dose Was 6.2864-1.938%.Drug which Was excr

32、eted totally in aline and feces in 72h after an oral administration of PS916WaS equal to 60.67%of given dose.PS916was mainly excreted from urine after oral administration.Key Words:marine sulfated polysaccharide PS916;fluroceseent labeling; pharmacokinetics8獨創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。

33、據(jù)我所知,除了文中特別加以標注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫 過的研究成果,也不包含未獲得 (蕉!麴逡直基絲壺要掛別童塑 的!奎攔亙窒2或其他教育機構(gòu)的學位或證書使用過的材料。與我同工作的同志對本研 究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名:乏乏牢 簽字日期:砒年6月/歹日 學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定,有權(quán)保留并向國家有 關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和磁盤,允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)學?？梢詫W 位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索,可以采用影印、縮印或掃描等復制手 段保存、匯編學位論

34、文。(保密的學位論文在解密后適用本授權(quán)書學位論文作者躲 乏乏。年 導師簽字:坳 簽字日期:矽讒年c7月K日 簽字日期:矽髫年6月7s日學位論文作者畢業(yè)后去向:工作單位:通訊地址: 電話:郵編海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究0前言糖類是在自然界中動物、植物和微生物體內(nèi)廣泛存在的一類物質(zhì),與蛋白質(zhì) 和核酸共同構(gòu)成生命三大物質(zhì)。糖的準確的化學定義為多羥基醛或酮,早期發(fā)現(xiàn) 的糖類化合物它們的分子式可以用通式(CH20n表示,因此糖又稱碳水化合物, 隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)一些化合物的結(jié)構(gòu)和糖類很相似,但分子中還具有氮、 硫等其它原子,僅用C、H、0-種元素和(CH20n的通式已不能完

35、全代表這一 類化合物,碳水化合物的概念已不斷擴大。糖分子中含有多個羥基,糖與糖之間 可通過糖苷鍵連接,進而又可將糖分為單糖、寡糖(2.10和多糖(>10。人們 對糖的早期認識只限于它可以作為能源物質(zhì)及細胞和組織的支撐結(jié)構(gòu)成分,1900年K.Landsteiner發(fā)現(xiàn)人的ABO血型系統(tǒng),經(jīng)過半個多世紀的研究,1960年W.M. Watkins確定了ABO抗原的決定基的糖鏈結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)A型和B型抗原僅有一個糖基 的差別【l】。1930年A.Fleming發(fā)現(xiàn)了青霉素,而青霉素的作用機制是抑制細菌肽聚 糖合成【21。50年代發(fā)現(xiàn)流感病毒入侵肌體亦與一種叫做唾液酸的糖分子有關(guān)13。 80年代末成功

36、克隆了糖基轉(zhuǎn)移酶,這在闡明體內(nèi)糖鏈合成機理過程中發(fā)揮了巨大 作用,使人們對糖鏈的復雜性和代謝過程有了更深的認識,對糖的生物功能有了 新的認識【4】。人們發(fā)現(xiàn)糖不僅廣泛參與了細胞各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié),同時還參與 細胞的轉(zhuǎn)化、分裂、再生等生理過程,糖與蛋白質(zhì)、脂類形成的糖蛋白、脂多糖 在細胞的識別、分泌以及在蛋白質(zhì)的加工和轉(zhuǎn)移方面起著不容忽視的作用,由此 逐漸發(fā)展形成了糖生物學【5】。糖生物學研究的一場革命發(fā)生在1990年,3個不同 的研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞一白細胞黏附分子(E.selectin,這種分 子能識別白細胞表面的四聚糖唾液酸路易斯X(Slex,這是第一次在人體中確 證了糖結(jié)合蛋

37、白與寡糖之間的識別功能,由此將糖生物學推向生命科學的前沿 【l】。糖類藥物的研究也在此背景下逐步發(fā)展。隨著糖化學與糖生物學的不斷發(fā)展,人們認識到糖類及其復合物具有重要的 生物功能,表現(xiàn)出多種生物活性,如免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究射、抗凝血、降血糖、降血脂等。目前普遍認為,多糖是一種無細胞毒的免疫促進劑,多糖的大多數(shù)生物活性 和功能均與免疫系統(tǒng)有關(guān)。多糖主要通過以下途徑發(fā)揮其免疫促進作用:1提高巨噬細胞(M西的吞噬能力,誘導白細胞介素I(1L.1和腫瘤壞死 因子(TNF的生成。具有這種免疫增強功能的多糖主要有香菇多糖、牛膝多糖、 枸杞

38、多糖、裂褶菌多糖、人參多糖、樹舌多糖、海藻多糖等。正常小鼠給予枸杞 多糖(LBP40mg/kg/d X 7d,ip,能增強經(jīng)刀豆素(Con A處理的MO對腫瘤靶細胞 增殖的抑制活性16】。從商陸塊根分離出來的酸性雜多糖PFP.I,能使ICR小鼠 腹腔MtI對￥180和L929腫瘤細胞產(chǎn)生明顯的細胞毒作用,促進細胞脂多糖 (LPS對IL一1和TNF誘生,其誘生IL一1的能力比卡介苗(BCG強,提示 PFP.I增強MO細胞毒的作用與其誘生IL.1和TNF密切相關(guān)171。人參多糖能直接 激活人的單核細胞,并分泌出白細胞介素.8(IL.8。IL.8是一種較強的趨化因子, 能趨化并激活中性粒細胞,促進其

39、溶酶體酶活性和吞噬作用,對嗜堿性粒細胞和 T細胞也有一定的趨化作用。此時IL.1也會隨著幾.8含量的升高而增加瞄J。 2促進T細胞增殖,誘導其分泌白細胞介素2(IL.2。具有這種免疫增強功 能的多糖主要有:中華獼猴桃多糖、豬苓多糖、刺五加多糖、人參多糖、靈芝多 糖、黃芪多糖、枸杞多糖等。以BALB/C小鼠為研究對象,分組灌服枸杞多糖、 環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺加枸杞多糖,測定總T淋巴細胞、TB、TH、TH/TB的數(shù) 量及淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明枸杞多糖能增加總T細胞及TH亞群百分含 量,提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率,對環(huán)磷酰胺所誘發(fā)的免疫功能低下反應,枸杞多糖還 有回復作用,使降低的總T細胞,TH、TH/TB

40、及淋轉(zhuǎn)率回復到正?；蚪咏?常對照水平91。Funoran從Gloiopeltistenax中提取的一種海藻多糖可誘導荷瘤小 鼠SRBC的遲發(fā)性超敏反應,增強脾淋巴細胞到漿細胞的轉(zhuǎn)化,增強外周血中 L3T4+和Lyt2+T細胞的百分率,增強輔助性T細胞、殺傷性T細胞、自然殺傷細 胞的活性1101。香菇多糖能明顯促進淋巴細胞激活因子(LAF的產(chǎn)生,促進幾.2產(chǎn) 生,促進多種未成熟的前T細胞成熟及向成熟T細胞分化,微量的香菇多糖 可使小鼠胸腺細胞對IL.2的反應性提高。香菇多糖是典型的T細胞激活劑, 它在體內(nèi)和體外均能促進特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL的產(chǎn)生,并提高CTL 2海洋多糖藥物PS916

41、的熒光標記及其藥代動力學研究的殺傷活性111】。靈芝多糖可通過間接激活淋巴細胞中DNA多聚酶,而促進 DNA合成及T細胞增殖,促進IL.2產(chǎn)生,從而影響T細胞亞群的數(shù)量和功 能【121。3促進淋巴因子激活的自然殺傷細胞呷<的活性。這類多糖有枸杞多糖、 刺五加多糖、黃芪多糖、鼠傷寒菌內(nèi)毒素多糖等。自然殺傷細胞(NK是生物體內(nèi) 天然存在的非特異的免疫殺傷細胞,它在宿主的免疫監(jiān)視功能中有著重要的作 用。牛膝多糖60mg/kg/d腹腔注射lOd不僅能對抗環(huán)磷酞胺(CY所致的小鼠外 周血中NKC活性降低,還能提高正常小鼠外周血中NKC活性【l引。人參多糖 能夠提高荷瘤小鼠的NKC活性,誘生腫瘤壞死

42、因子(TNF,通過內(nèi)源性生成的 多種細胞因子激活NKC與T淋巴細胞,對腫瘤細胞株起不同程度的殺傷和抑 制作用【14J。從多葉奇果菌(Grifolafrondosa分離得到的多糖D.片段,能激活腫 瘤患者體內(nèi)的NK細胞,使TNF一0【和Y干擾素(玳F.Y水平升高,同時還可以 通過激活巨噬細胞使IL-2分泌增加,后者也是NK細胞的激活劑,使NK細胞長期發(fā) 揮細胞毒作用,抑制腫瘤細胞的生長【15】。當歸多糖能增強白介素.2(IL.2、白 介素-4(IL.4、白介素一6(IL.6和INF.Y的表達,其過程是首先激活涉及非特異 性免疫作用的巨噬細胞和NK,然后是T輔助細胞,增加抗體數(shù)量,進而協(xié)同 增強免

43、疫功能116J。螺旋藻多糖(SPP毒性試驗表明,作為生物反應調(diào)節(jié)劑將其用 于白血病細胞治療可提高NK活性【17】。4提高B細胞活性,增加多種抗體的分泌,加強肌體的體液免疫功能。 這類多糖有:銀耳多糖、香菇多糖、苜蓿多糖、海藻多糖等?？诜显朴⒍嗵悄?提高老年鼠體液中IgM的數(shù)量【18】。用熱水提取的可食性褐藻多糖能誘導小鼠脾 細胞增殖,B細胞及其所分泌的抗體IgM和IgG的數(shù)量增加;是小鼠B細胞 的有絲分裂原,具有多克隆激活B細胞增殖作用,而對T細胞沒有誘導增殖 作用1191。當歸多糖在體內(nèi)外均能使多克隆流性的小鼠B淋巴細胞活化,對當歸 多糖應答的B細胞可分化到不同成熟階段,部分細胞群成熟為抗

44、體分泌細胞 【201。牛膝多糖能明顯提高正常小鼠血清總IgG及特異性溶血素水平,增加脾臟 PFC數(shù)目,對抗環(huán)抱霉素A引起的PFC及IgG水平的下降,增強小鼠單核巨 噬細胞的吞噬功能【211。5通過不同途徑激活補體系統(tǒng),有些多糖是通過替代通路激活補體,有些海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究則通過經(jīng)典途徑起作用。這類多糖有:酵母多糖、當歸多糖、茯苓多糖、車前子 多糖、細菌脂多糖、香菇多糖等。研究表明,抗補體活性多糖大多為酸性雜多糖, 其酸性部分主要是半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。從麝香草葉中得到的酸性多糖 (Tv.3.IAII?？梢酝ㄟ^經(jīng)典途徑和替代途徑激活補體系鰣221。從竹芽中分離

45、出的組分(BS.BGA可通過替代途徑激活補體,其結(jié)構(gòu)是具有B一(1_4側(cè)鏈 的B.(13葡聚糖【23J。多糖的體內(nèi)、外抗病毒活性已得到廣泛證實,其抗病毒的機制可分兩類:一 是對病毒的直接抑制作用,包括對病毒附著細胞、進入細胞以及病毒復制的抑制; 二是間接作用,即調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)、增強抗病毒的免疫反應。病毒必須吸附與 穿入敏感細胞才能引起感染,吸附分為兩個階段,一是病毒體與細胞接觸,進行 靜電結(jié)合,此過程是非特異的、可逆的;二是病毒體表面位點與宿主細胞膜上相 應受體結(jié)合,此過程是特異的、非可逆的。這一識別、吸附的過程多由細胞表面 蛋白質(zhì)和糖蛋白介導。1981年,Rossignol等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性硫酸

46、多糖在細胞吸附和識 別中發(fā)揮作用【241。隨后在多種形式的細胞吸附與識別研究中,發(fā)現(xiàn)硫酸化多聚陰 離子結(jié)構(gòu)起了重要而特殊的作用。利用藥物來干擾這些識別吸附過程就可起到抗 病毒作用。病毒進入細胞后要進行DNA的復制、蛋白質(zhì)的表達以及核酸與蛋白 質(zhì)外殼的裝配等步驟,這些步驟是非常復雜的生物化學反應,篩選的藥物能抑制 這些步驟中的某一反應就可以抑制病毒的復制與增殖;另外,藥物還可以通過啟 動免疫系統(tǒng)來消滅病毒。一些天然多糖和化學修飾的天然多糖對人體免疫缺陷病 毒(HIV、單純皰疹病毒(HSV、柯薩奇病毒(cvm、巨細胞病毒(CMV、 流感病毒(influenzaAvirus、肝炎病毒等有顯著的抑制作

47、用。具有抗病毒活性的 多糖主要是一些硫酸化多糖,自從Nakashim等人報道卡拉膠具有抑制單疤疹病毒 復制的作用以來,硫酸多糖逐漸引起人們的關(guān)注【251。硫酸多糖是指糖羥基上帶有 硫酸根的多糖,包括天然提取的各種硫酸多糖以及中性多糖的硫酸化衍生物等。 硫酸多糖抗病毒的可能機制:一是硫酸化多糖的多聚陰離子結(jié)構(gòu),因為病毒對宿 主細胞的感染需經(jīng)過病毒體表面位點與宿主細胞受體部位的可逆與不可逆結(jié)合 兩個階段,硫酸多糖正是在這種結(jié)合過程中發(fā)揮抗結(jié)合的關(guān)鍵作用;二是競爭性 抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性,從而阻止病毒的復制,是多糖抗病毒的另一種機制;再 4海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究則是通過增

48、強免疫功能提高機體抗病毒能力。硫酸酯化多糖的抗HIV-1作用, 已經(jīng)有很多報道,硫酸化多糖為聚陰離子,可以與HIV病毒外膜蛋白上或CD4某些敏感結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用,掩蔽活性區(qū)域,從而抑制H對細胞的吸附或融 合,使其不能進入細胞進行復制。抑制病毒原理主要基于阻斷HIV-1結(jié)合細胞 環(huán)節(jié),抑制HIV感染免疫細胞,從而抑制病毒大量繁殖【26-29。硫酸多糖911與 細胞和病毒共同培養(yǎng),在不同時間內(nèi)檢測培養(yǎng)上清液中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性,發(fā)現(xiàn)硫 酸多糖911對逆轉(zhuǎn)錄酶活性有明顯的抑制作用?，F(xiàn)有學者認為,硫酸多糖分子中 硫酸化側(cè)鏈與模板引物上的某些酶具有相同的結(jié)合位點,從而產(chǎn)生競爭性抑制作 用【301。新近的一

49、些研究又發(fā)現(xiàn)硫酸多糖與HIV-1Tat蛋白結(jié)合可以抑鋁IJHIV-11311。 HIV-1Tat蛋白是一種特殊的轉(zhuǎn)錄因子,它能進入細胞,轉(zhuǎn)運至細胞核,刺激 HIV"UR+的轉(zhuǎn)錄活性,對病毒的復制和整合起重要作用。硫酸細菌糖胺聚糖對 H有體外抑制活性,它阻止合細胞的形成,阻斷病毒對宿主細胞的吸附。加之 硫酸細菌糖胺聚糖的抗病毒活性與抗凝血活性比值較高,引起出血的副作用小, 使其極有可能用于臨床p21。Collins等【33】從食用菌Coriolus versicolor中提取到的多 糖肽能抑制HIV-1的gpl20與CD4受體的相互作用,抑制重組HIV-1逆轉(zhuǎn) 錄酶;還能抑制作用于病毒

50、蛋白質(zhì)加工過程的糖羥基化酶的活性。小分子量的牛 膝多糖有免疫增強作用,卻無抗病毒活性,經(jīng)硫酸化處后,產(chǎn)生較強抗乙肝病毒 HBsAg和HBeAg的活性【341;豬茯苓多糖能抑HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HbsAg表達, 從而抑制肝炎病毒【35】。從海藻(Sargassum Homert中熱水提取的硫酸多糖,通過 抑制病毒的吸附結(jié)合及病毒復制而具有抗HSV-I、CMV病毒活性【36J?？鼓[瘤作用是多糖類化合物所顯示的主要生物活性,就多糖的抗腫瘤作用來 說,可將抗腫瘤多糖分為兩大類:一類是具有細胞毒性的多糖直接殺死了腫瘤細 胞,這類多糖有牛膝多糖、茯苓多糖、刺五加多糖、銀耳多糖、香菇多糖、云芝 多糖等:第二類抗

51、腫瘤活性多糖是作為生物免疫反應調(diào)節(jié)劑,通過增強肌體的免 疫功能而間接抑制或殺死腫瘤細胞,這與前面提到的多糖的免疫調(diào)節(jié)活性是一致 的,具有抗腫瘤活性的多糖大多是通過這種途徑起作用的,即具有宿主介導的抗 腫瘤活性。研究表明一些多糖對腫瘤細胞有直接作用,從而改變了多糖無細胞毒 性的觀點。對腫瘤細胞的直接作用與多種途徑有關(guān):影響細胞膜的生化特性,海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究腫瘤細胞膜唾液酸含量的變化與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系,茯苓多糖(PPS、刺 五加多糖(APS在體外對S180、K562有直接抑癌作用,并使腫瘤細胞唾液酸升高, 磷脂減少【37】。進一步研究發(fā)現(xiàn),PPS使S180與

52、K562細胞膜磷脂脂肪酸組成發(fā)生 明顯改變,PPS干擾膜的肌醇磷脂代謝,明顯抑制磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)換,推測PPS的 抗腫瘤機理與膜生化特性改變有關(guān)【38】。影響腫瘤細胞內(nèi)信號傳遞途徑:豬苓多 糖通過抑制磷酸二酯酶活性而提高細胞內(nèi)cAMP水平。進一步的研究發(fā)現(xiàn)豬苓 多糖與茯苓多糖對HL260細胞質(zhì)和胞膜兩部分的酪氨酸蛋白激酶活力有不同的 激活作用,提示2種多糖抗腫瘤的機制可能與酪氨酸蛋白磷酸化水平下降有關(guān)【391。 誘導腫瘤細胞凋亡:地黃低聚多糖(LRPS能使Lewis肺癌細胞內(nèi)的p53基因表達 增加,可通過調(diào)控p53基因的表達而影響腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡140】。枸杞多 糖對高轉(zhuǎn)移人肺癌PG細胞

53、的細胞凋亡呈時間和劑量依賴性,枸杞多糖誘導的 細胞凋亡以loop咖L最明顯14¨。梁金菇多糖則通過增加Caspase23基因表達促使 HL260細胞凋亡【421?？棺杂苫饔?無花果多糖可提高荷S180dx鼠血清的 SOD、GSH2px活性和降低自由基水平而抗腫瘤f431。海藻多糖能減少白血病L615小鼠脂質(zhì)過氧化物含量而增加過氧化氫酶、SOD的活力,表明海藻多糖能抑制自 由基的產(chǎn)生和加快自由基的清除,減少或防止原初氫氧自由基和單線態(tài)氧的產(chǎn) 生,使細胞分裂發(fā)生抑制,導致腫瘤生長抑制】。阻斷癌細胞DNA的合成:羥甲基茯苓多糖對人早幼粒白細胞的IC50為58眥,可使G0、Gl期細胞增加,

54、 S、G2期細胞下降而抑制DNA的合成【451?？雇蛔冏饔?關(guān)于癌變機理存在 多種學說,著名的為體細胞多次突變理論。實驗研究表明,許多多糖能減少染色 體畸變、SCE和微核的發(fā)生率,可用于腫瘤的預防和治療,如人參多糖可使CTX 誘變的小鼠活體骨髓細胞SCE頻率明顯下降【46】。黃芪多糖、天冬多糖等均有抗 突變作用H71。多糖抑制腫瘤血管形成:現(xiàn)已證實,實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移與新生 血管的形成有密切關(guān)系【4引。腫瘤的血管系統(tǒng)己成為1個嶄新的有希望的抗腫瘤治 療靶點。云芝多糖、香菇多糖、蟲草多糖等均能誘生n師f49】;黃芪多糖、當歸 多糖、黨參多糖、豬苓多糖等皆可誘生IFN50】。多糖具有抗衰老作用,其

55、機制一方面作為免疫調(diào)節(jié)劑上調(diào)機體的免疫功能; 另一方面可以增強機體對自由基的清除能力和抗氧化能力,增強機體抗氧化酶活 6海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究力。自由基過?？烧T發(fā)炎癥、免疫失調(diào)、惡性腫瘤等多種疾病,也是促進機體衰 老的因素之一。脂質(zhì)過氧化是氧自由基損傷組織的重要方式,其損傷途徑為:氧 自由基+細胞膜脂質(zhì)_脂質(zhì)過氧化反應一過氧化脂質(zhì)_÷丙二醛+細胞成分_÷脂褐質(zhì)?？梢?脂質(zhì)過氧化與氧自由基及衰老密切相關(guān);丙二醛和脂褐質(zhì)是脂質(zhì) 過氧化的產(chǎn)物,其含量的變化間接反應了氧自由基的含量。機體自身存在抗氧化 系統(tǒng),SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶,清除超氧陰離子自由

56、基(023,保護細胞免受 損傷。GSH.Px是體內(nèi)過氧化氫分解的催化酶,它對活性氧和羥自由基(OH誘 發(fā)的脂氫過氧化物及組織產(chǎn)生的H202有較強的清除能力,可以起到保護細胞結(jié)構(gòu) 和功能完整的作用。NOS是L.Arg和分子氧反應生成NO的催化酶,NO是巨噬 細胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵介質(zhì),也是血管舒張必須依賴的因子,高血壓、腎炎等多種 疾病狀態(tài)下體內(nèi)NO減少。正常情況下,36周齡和60周齡小鼠與10周齡小鼠相 比,體內(nèi)抗體IgM水平分別降低60%和70%,從紫云英根(Astralus sinucus L 中提取的粗多糖對不同周齡小鼠(10.36.60進行實驗,36周和60周小鼠的IgM 水平顯著高于相應

57、的對照組,而lO周齡小鼠與對照組相比無差異。提示該多糖成 分科上調(diào)老齡鼠的免疫功能【5ll。黨參多糖能不同程度對抗衰老機體免疫器官退化 及提高免疫功能,能使胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)不同程度回升;血清和肝組織中MDA 及腦組織中LF明顯降低;血清、肝組織中SOD、腎組織中GSH.Px及NOS酶 活力明顯上升。能不同程度地清除OH和抗脂質(zhì)過氧化:能不同程度地清除 02一,H202及活性氧;可不同程度上調(diào)體內(nèi)NO,提高機體生理機能152。紅芪多 糖(HPS能明顯延長果蠅的壽命,提高老年小鼠對有害刺激的非特異性抵抗力, 降低動物血漿中過氧化脂質(zhì)含量,減少脂褐素形成,并可能清除細胞中已形成的 脂褐素【531。

58、螺旋藻多糖(PSP是從螺旋藻中分離純化獲得的平均分子量為 16.6kDa的酸性多糖,對D.半乳糖所導致的衰老小鼠模型有如下作用:抗小鼠肝、 腦組織單胺氧化酶(MAO.B的活性明顯提高,抗Na-K.ATP酶活性降低,對抗 小鼠淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化降低的效應,拮抗小鼠皮膚細胞中羥脯氨酸含量降低,從 而防止膠原蛋白多肽鏈之間交聯(lián)度的增加,代謝率降低,防止皮膚組織彈性降低 154。女貞子多糖能劑量依賴地抑制衰老模型小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的下降和腦 組織中脂褐質(zhì)含量的升高;抑制心、肝、腎組織中MDA含量升高和SOD及GSH2Px 活性下降,可顯著抑制機體免疫器官退化及提高免疫功能,清除羥自由基,超氧海洋多糖

59、藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究陰離子自由基和活性氧,提高抗氧化酶活力【551。波葉大黃多糖能明顯延長兩性果 蠅平均壽命,具有延緩衰老作用【561。枸杞多糖能提高果蠅平均壽命,有效對抗自 由基過氧化,抑制衰老模型小鼠體內(nèi)丙二醛和脂褐素含量的增加:降低老年小鼠 血清內(nèi)MDA含量【571。從中藥黃精中提取的一種小分子量中性多糖,在動物實驗 中能顯著地延長果蠅壽命,促進老齡大鼠學習和記憶能力,改善老齡大鼠血漿 SOD酶活性、肝臟脂褐素含量、心臟過氧化脂質(zhì)含量和腦組織B型單胺氧化酶活 性等與衰老相關(guān)生化指標,與對照藥喜得鎮(zhèn)相比較,具有療效相同而副作用小的 特點。另外,研究人員在對構(gòu)祀、當歸多糖的研究中也發(fā)現(xiàn)其有明顯的抗氧化、 抗衰老功效【5s,59。多糖調(diào)節(jié)血糖水平的可能機制主要是:1它能提高肝臟中葡糖激酶、己糖 激酶和6.磷