液相色譜法測定豬和牛脂肪中孕酮?dú)埩袅?1)

1、液相色譜法測定豬和牛脂肪中孕酮?dú)埩袅?1)        作者; 姜維，方曉明，唐毅鋒，龐國芳【摘要】 目的 建立脂肪中醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮?dú)埩袅康臏y定 方法 。方法 色譜柱：kromasil c18（250mm×4.6mm，5m）；流動(dòng)相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱溫：35；檢測波長：292nm；進(jìn)樣量：40l。結(jié)果 樣品的室內(nèi)加標(biāo)平均回收率為86.791.8，室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.56.0，室間加標(biāo)平均回收率為81.495.0，室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.77.1

2、，定量測定低限（loq）為10g/kg。結(jié)論 本方法簡便，準(zhǔn)確，可用于脂肪中醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮?dú)埩艉康臏y定。        【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法;脂肪;醋酸美侖孕酮;醋酸甲地孕酮;醋酸氯地孕酮    determination of progestones in fat of beef and pork by hplc    【abstract】 objective to establish the det

3、ermination method of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.methods chromatographic separation was carried out on a c18column（250mm×4.6mm，5m）and acetonitrile-water (65:35) as the mobile phase. the flow rate was 1.0ml/min; the column temperature

4、was 35; the detection wavelength was 292nm; the injection volume was 40l.results the intra-laboratory average recoveries ranged from 86.791.8 and rsd of 4.56.0.the inter-laboratory average recoveries added to standard ranged from 81.495.0 and rsd of 3.77.1.the lowest limit of quantitation (loq) is 1

5、0g/kg.conclusion the method is simple and sensitive.it is suitable for the determination of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.    【key words】 hplc; fat; melengestrol acetate; chlormadinone acetate; megestrol acetate 

6、0;      醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮為合成的孕激素類藥物，有明顯的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素對垂體促性腺激素的釋放有一定的抑制作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)惡心、頭暈、倦怠；(2)突破性出血；(3)孕期服用，會(huì)增加女性后代的男性化作用。孕激素類藥物能增強(qiáng)體內(nèi)物質(zhì)沉積和改善生產(chǎn)性能，可以很快產(chǎn)生顯著和直接的 經(jīng)濟(jì) 效益，因此，對生產(chǎn)者有很大的吸引力。畜牧業(yè)中使用孕激素類藥物(非 治療 用途)已有很長的 歷史 ，但人類長期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦會(huì)明顯 影響 機(jī)

7、體的激素平衡，而且有致癌危險(xiǎn)，對幼兒造成發(fā)育異常等危害。因此，開發(fā)一種能檢測孕酮?dú)埩袅康姆椒ㄊ鞘直匾摹?#160;       檢測孕激素類藥物的方法有很多，如液相色譜/質(zhì)譜法（lc/ms）1、氣相色譜/質(zhì)譜法（gc/ms）2，3和液相色譜法46等。本文采用高效液相色譜法對牛和豬脂肪樣品中的孕酮進(jìn)行檢測。        1 試劑與儀器         試劑 醋酸美

8、侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)品（sigama公司），乙腈（hplc級），甲醇（hplc級），乙酸乙酯（hplc級），其他試劑為 分析 純。水由milli-q凈化系統(tǒng)（millipore公司）制得。        （1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1000g/ml，分別準(zhǔn)確稱取0.050g醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)品于50ml容量瓶中，用甲醇定容。于4保存，可使用一年。        （2）混合中間溶液i：100g/ml，分別

9、吸取10.0ml醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4保存，可使用一年。        （3）混合中間溶液ii：1.0g/ml，取1.00ml混合中間溶液i于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4保存，可使用半年。        （4）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取10、20、40、80、100l混合中間溶液ii添加到980、970、950、910、890l的乙腈-水（65:35）中，再加入10

10、l 0.2%鹽酸溶液，混勻，得到濃度為0.010g/ml、0.020g/ml、0.040g/ml、0.080g/ml和0.10g/ml混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，供液相色譜測定，當(dāng)日使用。         儀器 waters液相色譜系統(tǒng)，510泵體，486紫外-可見光檢測器，emprower pro色譜軟件。氮?dú)獯蹈蓛x（organomation associates，jnc.公司）；固相萃取裝置（supelco公司）；低溫離心機(jī)（德國eppendorf公司）；渦旋混勻器（xw-80a型，上海醫(yī)大儀器廠）；cn固相萃取柱（3ml

11、，waters公司）。        2 測定步驟     試樣的制備與保存         試樣的制備 把大約5g的豬或牛脂肪組織切成小塊，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入150ml的燒杯中，將燒杯置于微波爐內(nèi)。根據(jù)所熬制脂肪量，使用最大功率，加熱3060s，如果脂肪沒有融化，可在間隔3060s以后重復(fù)加熱3060s，直到有液體脂肪流出，通過漏斗滴入燒杯中。把熬制好的脂肪油放入樣品瓶中，密封

12、，并做上標(biāo)記。     樣品的保存 把熬制好的脂肪油樣品置于-18中，冷凍保存。         提取 稱取熬制好的脂肪油2.00±0.01g，置于50ml具塞離心管中，加入5ml乙腈，于60水浴中保溫3min以使固體脂肪溶化，渦旋振搖1min，在-5下離心7min（離心力1160g），吸取上清液至15ml帶塞聚丙烯離心管，再在沉淀物中加入5ml乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2×2ml正己烷，渦旋振搖1min，于-5中離心5min（離心力1160g），棄去正己烷層。乙腈提取液于60中用氮?dú)獯蹈蓛x吹干，殘?jiān)砘?#160;        皂化 在殘?jiān)?.2項(xiàng)）中依次加入4ml正己烷、