濕阻中焦證模型胃腸水通道蛋白0(AQP0)的病理特征性表達(dá)分布譜

1、濕阻中焦證模型胃腸水通道蛋白0（AQP0）的病理特征性表達(dá)分布譜以及平胃散干預(yù)的研究曾躍琴 陳繼蘭 黃秀深 李煒弘 秦健（成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都611137）摘要：目的：觀察并分析水通道蛋白0（AQP0）在大鼠消化段（胃賁門(mén)、胃體中部、大腸中段、大腸末段）的差異性表達(dá)，推測(cè)其與消化道生理功能的相關(guān)性及平胃散對(duì)消化道水液代謝的干預(yù)機(jī)制。方法：通過(guò)對(duì)三大致濕因素的聯(lián)合應(yīng)用（外濕過(guò)盛，礙胃困脾；飲食不節(jié)，內(nèi)生濕邪；情志不遂，水濕失布），建立濕困中焦的動(dòng)物病理模型，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)AQP0在消化段的分布及表達(dá)情況。結(jié)果：AQP0主要在消化道的粘膜層表達(dá)，粘膜下層、肌層和外膜處可有疑似表

2、達(dá)?？瞻捉M與模型組相較而言：AQP0在胃賁門(mén)粘膜層表達(dá)有增加的趨勢(shì)。自然恢復(fù)三天后，相較于模型組：AQP0在胃賁門(mén)粘膜層，大、小腸中段表達(dá)有增加的趨勢(shì)，胃體中間有降低的趨勢(shì)。經(jīng)平胃散干預(yù)三天后，相較于模型組：AQP0在胃賁門(mén)和大腸中段粘膜層有增加的趨勢(shì)，胃體中部和小腸中段粘膜的表達(dá)略有降低。且平胃散干預(yù)組與自然恢復(fù)組比較，AQP0在胃賁門(mén)、胃體中部、小腸中段粘膜層的表達(dá)有所降低。同時(shí)，空白給藥組相較于空白組而言：AQP0在消化道各段粘膜層的分布有增加的趨勢(shì)。結(jié)論：（1）AQP0在消化道粘膜層表達(dá)，可能與水分吸收，腺體分泌的調(diào)控機(jī)制相關(guān)；（2）AQP0在胃和腸的表達(dá)有差異，內(nèi)環(huán)境PH可能是影響因

3、素之一；（3）平胃散能促進(jìn)AQP0的表達(dá)，可以通過(guò)AQP0維持水液代謝的平衡，這可能是平胃散燥濕健脾，散滿和胃在分子水平的機(jī)制之一。關(guān)鍵詞：平胃散、濕阻中焦動(dòng)物模型、水通道蛋白0A Study on Expressional Distribution Spectrum of the Pathological Features of Aquaporin0（AQP0）in a Animal Model on the Syndrome of Dampness Incumbering Middle Energizer in Gastrointestinal Tissue and the Interve

4、ntion by Pingwei DosageYueqin Zeng Jilan Chen Xiushen Huang * Weihong Li Jan Qin(Basic Medical College of Chengdu University of TCM , Chengdu 611137) 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30973713）作者簡(jiǎn)介：曾躍琴（1983），女，籍貫四川廣漢，在職碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事中醫(yī)診斷理論研究，以及模型動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究。通訊作者：黃秀深，成都中醫(yī)藥大學(xué)溫江校區(qū)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，成都市溫江區(qū)柳臺(tái)大道1166號(hào)，黃秀深（收） 郵編：6111

5、37AbstractPurpose: Observation and analysis the different expression of water channel protein 0 （ AQP0 ） in rats digestive tract （Cardia of stomach、the middle of stomach、the middle of small intestine、the middle of large intestine 、the end of large intestine）,Speculate the relevance between AQP0 and

6、the physiologic function about alimentary canal and the mechanism about the pathogenesis in disturbance of water metabolism caused by Pingwei Dosage.Method: United three major pathogenic factors(the functioning declination of Spleen and Stomach by exterior Dampness luxus, interior Dampness caused by

7、 intemperant diet, or stagnation of Qi caused by emotional depression),Build a model of the Syndrome of Dampness Incumbering Middle Energizer, Measure the distribution of the AQP0 in the gastrointestional tissue by Immunohistochemistry.Result: expressional content of AQP0 Concentrated in mucosa f th

8、e alimentary canal,the expression in other parts are pared with the model team, expressional content of AQP0 in blank team enhanced in mucosa tissue of the cardiac stomach;after three days renew, expressional content of AQP0 enhanced in mucosa tissue of the cardiac stomach,the middle of small/large

9、intestine,but reduced in the middle of the stomach; Pingwei dosage enhanced the expressional content in mucosa tissue of the cardiac stomach and the middle of large intestine,reduced little in middle part of the stomach and small pared with the renew team,using pingwei dosage can reduce the expressi

10、onal content in mucosa tissue of the cardiac stomach 、the middle of the stomach and small pared with blank team, using pingwei dosage can enhance the expressional content in mucosa tissue in the whole alimentary canal.Conclusion: (1)AQP0 that expressed in gastrointestional tissue may be one of the m

11、olecular basis in moisture absorption、glandular secretion.(2)The expression content of AQP0 are different between the stomach and the intestine,maybe it caused by the distinct Ph.(3) Pingwei dosage can enhanced the expression of AQP0 and Maintain the balance of the metabolic of water by AQP0,maybe i

12、ts one of the reason which can explain pingwei dosages efficacy on eliminating Dampness to activate Spleen, scattering stagnant to comfort stomach.Key words: Pingwei Dosage；the Model of the Syndrome of Dampness in cumbering Middle Energizer; Aquaporin-0（AQP0）易·乾云：“同聲相應(yīng)，同氣相求”，葉選醫(yī)衡言：“濕者，更喜浸于脾胃者，以

13、其同氣相感也”。脾胃作為同居中焦，表里配屬，陰陽(yáng)相對(duì)的土象之臟，通過(guò)納運(yùn)協(xié)同、氣機(jī)順因、燥濕相濟(jì)的方式維持著機(jī)體內(nèi)部的水液代謝的平衡。水通道蛋白是目前研究較熱的一類與水通透相關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1-3，編號(hào)從012，共計(jì)十三種，廣布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，尤其與吸收和分泌相關(guān)的內(nèi)皮和上皮細(xì)胞中較多4。文獻(xiàn)已有1、2、3、4、5、7、8、9、10、12在消化道表達(dá)的相關(guān)報(bào)道5-6。鑒于二者可能在水液代謝方面存在因果關(guān)系，故本課題旨在通過(guò)對(duì)水通道蛋白在消化道分布情況的系統(tǒng)性研究，探求傳統(tǒng)中醫(yī)典型藥證關(guān)系-平胃散對(duì)濕阻中焦證的可能調(diào)控機(jī)制。本文在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇尚未或尚少見(jiàn)刊的水通道蛋白0做一定的相關(guān)闡述。

14、1 實(shí)驗(yàn)材料1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠50只，雌雄各半，體重180220g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(川)200411，檢疫后備用。適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，自由攝食全價(jià)顆粒飼料，動(dòng)物房溫度維持在18-25左右。1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 造模用藥成都人人樂(lè)超市購(gòu)買(mǎi)的熟豬油，自制4冰水。 治療用藥平胃散（蒼術(shù)24g、厚樸18g、陳皮12g、炙甘草6g），均購(gòu)自同仁堂成都分店，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)制劑室鑒定合格。先將藥物加水浸泡1小時(shí)，然后與大棗2枚、生姜2片一同煎煮，最后濃縮成濃度為1g生藥/ml的藥液。1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑PBS緩沖液（博士德生物工程有限公司）；兔sp檢測(cè)試劑盒（中杉金橋，

15、批號(hào)：701323A）；DAB顯色試劑盒（中杉金橋，LOT:614846A）；AQP0（sc-99059, Lot:G2409）。1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器自制造模箱；T-5000型電子天平（常熟雙杰測(cè)試儀器廠）；RM2245切片機(jī)，（德國(guó)Leica公司）；HI1220烤片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；HI1210攤片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；EG1160包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BX51研究顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DFC-300FX數(shù)碼顯微攝像系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 造模分組及給藥SD大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)成組，其中20只進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，30只用于模型制備。以致濕病因

16、為藍(lán)本，分別從環(huán)境、飲食、情志三方面著手建立濕阻中焦證模型。將造模大鼠放在溫度18-25，濕度90%±5的造模箱內(nèi)飼養(yǎng)，模擬“久居濕地，外濕過(guò)盛”；造模大鼠于單日禁食并4冰水（2ml/只）灌胃一次，雙日供應(yīng)充足飼料并豬油（4ml/只）灌胃一次，模擬“飲食不節(jié)，饑飽失?！保涣钤炷４笫笥诿咳?：00-16：00站在4cm深的水中，控制睡眠時(shí)間7小時(shí)，擾亂其生物節(jié)律，模擬“情志不遂，水濕失布”；連續(xù)20日。造模結(jié)束當(dāng)日，常規(guī)飼養(yǎng)的20只大鼠隨機(jī)分為空白組和空白給藥組，已造模的30只大鼠隨機(jī)分為濕阻中焦證模型組（模型組）、平胃散治療組（平胃散組）和自然恢復(fù)組。并把空白組和模型組處死取材。次日

17、空白給藥組和平胃散治療組大鼠給予平胃散湯劑灌胃(10ml/Kg)，同時(shí)空白組和自然恢復(fù)組0.9%生理鹽水灌胃(10ml/Kg)，給藥3日后處死取材。2.2 胃腸組織取材標(biāo)準(zhǔn)取胃賁門(mén)（從賁門(mén)中間分開(kāi)，右側(cè)固定）、胃體中部（右側(cè)固定）、小腸中段（取距幽門(mén)1621cm之間，1618cm固定）、大腸中段（取距盲端611cm之間，68cm固定）、大腸末端（取距肛門(mén)5cm，2.55cm固定），以上各部組織均已生理鹽水沖凈內(nèi)容物后固定于15的中性甲醛（PBS配制），48h后制成病理石蠟包埋塊，4冰箱凍存?zhèn)溆?。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)AQP0在胃腸組織的分布情況進(jìn)行檢測(cè)：以4m厚度連續(xù)切片，60烘箱過(guò)夜；二甲苯

18、I、II、III脫蠟，共3次，每次15min；無(wú)水乙醇I、II各5min；95%乙醇I、II各5min，80%、70%乙醇各5min，流水沖洗后浸泡于蒸餾水中備用；PBS浸洗2次各5分鐘；中火、于PH6.0的枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)；用蒸餾水配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗1次；PBS浸洗3min*3；滴加正常山羊血清封閉液（1:10），室溫20分鐘，甩去多余液體；滴加抗50ul,4過(guò)夜；PBS洗3min*3；滴加生物素化抗（1:100），2515min；PBS洗5min*4；滴加試劑SABC（1:100）2515min；PBS洗3min*3；DAB顯色：3-15mi

19、n；脫水、透明、封片、鏡檢。3 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)3.1 形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：分5級(jí)強(qiáng)度，-表示陰性，無(wú)表達(dá)；±表示略陽(yáng)性，似有表達(dá)；+表示陽(yáng)性范圍小，有表達(dá)；+表示陽(yáng)性范圍近一半，表達(dá)明顯；+表示陽(yáng)性分布接近整個(gè)區(qū)域，表達(dá)十分明顯。3.2 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)示意圖4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 胃腸組織AQP0的分布圖表表1 AQP1的分布胃腸組織組別粘膜外膜-±+-±+胃賁門(mén)空白10708000空藥02427010模型04408000自恢01528000平胃42128000胃體中間空白00177100空藥00177100模型00358000自恢40048000平胃30508000小腸中段空白53

20、008000空藥44008000模型08003500自恢03504400平胃80008000大腸中段空白80008000空藥62008000模型71008000自恢62008000平胃62008000大腸末端空白80008000空藥62008000模型62008000自恢62008000平胃62008000（備注：以上各組均含8個(gè)樣本量，數(shù)字系指此表達(dá)級(jí)別汗的樣本個(gè)數(shù)）由表1可知， AQP0主要在胃腸組織的粘膜層表達(dá)，外膜處可有疑似表達(dá)，粘膜下層和肌層基無(wú)表達(dá)?？瞻捉M與模型組相較而言：AQP0在胃賁門(mén)粘膜層表達(dá)有增加的趨勢(shì)。自然恢復(fù)三天后，相較于模型組：AQP0在胃賁門(mén)粘膜層，大、小腸中段表達(dá)

21、有增加的趨勢(shì)，胃體中間有降低的趨勢(shì)。經(jīng)平胃散干預(yù)三天后，相較于模型組：AQP0在胃賁門(mén)和大腸中段粘膜層有增加的趨勢(shì)，胃體中部和小腸中段粘膜的表達(dá)略有降低。且平胃散干預(yù)組與自然恢復(fù)組比較，AQP0在胃賁門(mén)、胃體中部、小腸中段粘膜層的表達(dá)有所降低。同時(shí)，空白給藥組相較于空白組而言：AQP0在消化道各段粘膜層的分布有增加的趨勢(shì)。4.2 胃腸組織AQP0的分布圖例 空中100倍 平中100倍 模中100倍 藥中100倍 自中100倍5 討論5.1 濕阻中焦證病理動(dòng)物模型的AQP0在消化道的表達(dá)譜分析濕阻中焦證以全身困倦、胸脘痞悶、腹脹便溏、口黏苔膩為主要表現(xiàn)，是臨床中醫(yī)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病證型7。本實(shí)驗(yàn)

22、通過(guò)對(duì)AQP0關(guān)于濕阻中焦動(dòng)物病理模型的觀察，發(fā)現(xiàn)相較于空白組而言，AQP0在胃賁門(mén)粘膜層表達(dá)有降低的趨勢(shì)。作為有弱的水通透性的AQP0，其表達(dá)的降低可導(dǎo)致細(xì)胞通透性的降低，從而引發(fā)胃部組織水腫，降低胃部神經(jīng)的敏感性和肌肉組織的節(jié)律性，影響胃對(duì)飲食物的消化吸收。與中醫(yī)濕阻中焦證之胸脘痞悶，納差腹脹等癥狀基本相符，故AQP0可能是從分子水平揭示濕阻中焦證胸脘痞悶，納差腹脹等癥狀的有力依據(jù)。自然恢復(fù)三天后，AQP0在胃體中間有降低趨勢(shì)看似異常，但有研究認(rèn)為AQP0存在著PH依賴性調(diào)節(jié)8，胃體處大部分分布的胃底腺是分泌胃液的主要腺體，故推測(cè)胃部腺體功能的差異可能對(duì)AQP0的表達(dá)產(chǎn)生一定影響，此種表達(dá)現(xiàn)象可能是PH和模型作用綜合調(diào)控的結(jié)果。大腸末段各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)類于陰性表達(dá)，可能是因?yàn)樗〗M織叫靠近肛門(mén)，順應(yīng)功能需要，粘膜層細(xì)胞有向復(fù)層扁平上皮轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，因而吸收功能減弱相關(guān)。5.2 平胃散作用后濕阻中焦證病理動(dòng)物模型的AQP0在消化道的表達(dá)譜分析平胃散原載于太平惠民和劑局方，功效燥濕健脾，消痞和胃，是治療濕滯脾胃的基礎(chǔ)。分析表明：空白給藥組相較于空白組而言：AQP0在消化道各段粘膜層的分布有增加的趨勢(shì)，平胃散干預(yù)三天后：AQP0在胃賁門(mén)和大腸中段粘膜的表達(dá)相對(duì)于模型組有增加的趨勢(shì)，均提示平胃散具有