干擾RNA抑制小鼠視網(wǎng)膜HIF-1α蛋白質(zhì)的表達(1)

1、    干擾RNA抑制小鼠視網(wǎng)膜HIF-1蛋白質(zhì)的表達(1)    】 目的：探討缺氧誘導因子-1（HIF-1）特異性小片段干擾性RNA（siRNA）對小鼠視網(wǎng)膜HIF-1蛋白質(zhì)的抑制作用。方法：構(gòu)建HIF-1 siRNA重組質(zhì)粒pSUPERsiHIF-1。選擇7d齡C57BL/6J小鼠24只，其中6只為正常組（A）；另18只建立缺氧誘導的視網(wǎng)膜新生血管模型，并隨機分為：對照組（B）、空載體組（C組）和基因治療組（D組），每組6只。于出艙前1d，向空載體組小鼠玻璃體腔注射pSUPER空載體質(zhì)粒；基因治療組注射HIF

2、-1 siRNA 重組質(zhì)粒pSUPERsiHIF-1。采用FITC-Dextran熒光造影視網(wǎng)膜鋪片觀察4組小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)變化； SP免疫組織化學檢測各組間HIF-1的表達差異。 結(jié)果：熒光造影視網(wǎng)膜鋪片顯示，A組整個視網(wǎng)膜血管分布呈均勻網(wǎng)狀；B、C組視網(wǎng)膜中周部可見大片無灌注區(qū)，見新生血管叢，伴熒光滲漏；D組無灌注區(qū)較B，C組明顯減少，周邊部毛細血管網(wǎng)基本正常，新生血管叢明顯減少。免疫組織化學染色顯示，A組HIF-1蛋白表達陰性；B，C組在神經(jīng)節(jié)細胞層呈陽性表達； D組在神經(jīng)節(jié)細胞層呈弱陽性表達，較B，C組明顯減少。 結(jié)論：采用玻璃體腔注射，通過脂質(zhì)體介導HIF-1 siRNA重組質(zhì)粒p

3、SUPERsiHIF-1轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜，有效地抑制了缺氧誘導的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型視網(wǎng)膜中HIF-1蛋白質(zhì)的表達及視網(wǎng)膜新生血管的形成。 【關(guān)鍵詞】 小干擾RNA缺氧誘導因子-1視網(wǎng)膜新生血管基因治療 Inhibitory effect of interfering RNA targeting HIF-1 protein in mice retina    Abstract AIM: To investigate the inhibitory effect of interfering RNA targeting HIF-1 protein in the

4、retina of mice.METHODS: HIF-1 siRNA was constructed (pSUPERsiHIF-1). There were 6 seven-day-old C57BL/6J mice in the normal group (A), and another 18 mice were divided randomly into control group (B), vector group (C) and gene therapy group (D), with 6 mice in each group, which were induced for reti

5、nal neovascularization by hypoxia. Liposome with vector plasmid and HIF-1 siRNA were injected into the vitreous in the vector group and gene therapy group respectively at 1 day before mice were moved out to room air from the cabin. FITC-Dextran angiography was used to observe the pattern of the reti

6、nal vascular. The expression of HIF-1 protein among each group was detected using SP immunohistochemistry.RESULTS: Retinal flat-mounts after FITC-Dextran angiography indicated that the vessels of normal mice formed a fined radial branching pattern in group A. While the large vessels were distorted,

7、the capillary was obstructed, neovascular clusters proliferated and fluorescence leaked in the periphery of the retina in groups B and C. After transfection of HIF-1 siRNA into the retina, the retinal neovascularization and non-perfusion distraction in group ) reduced and the structure of retina wer

8、e more regular than those in groups B and C. Immunohistochemical staining showed that HIF-1 expressed mainly in the retinal ganglion cell layer in groups B and C, but not in group A. After transfection of HIF-1 siRNA into the retina, the expression of HIF-1 was downregulated compared with groups B a

9、nd C. CONCLUSION: The development of retinal neovascularization is inhibited markedly by intravitreal injection of HIF-1 specific recombinant plasmid pSUPERsiHIF-1, which suggests that it may have a potential therapeutic approach in retinal vascular disease.    · KEYWORDS: R

10、NA small interference; hypoxia inducible factor-1; retinal neovascularization; gene therapy0引言    視網(wǎng)膜缺血缺氧導致的視網(wǎng)膜新生血管性疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病變等為一組嚴重的致盲疾病。目前,臨床上使用光凝術(shù)預防和治療其新生血管的形成，但是,光凝存在許多并發(fā)癥和副作用，如術(shù)后相應視野縮小、光凝過量還可引起出血、脈絡膜新生血管形成等。因而非常有必從基因和分子水平尋求抑制視網(wǎng)膜新生血管形成的方法。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growt

11、h factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細胞的特異性有絲分裂原，對血管形成具有重作用1。同時，VEGF的活性亦受到多種因素的調(diào)控。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在缺氧組織中的轉(zhuǎn)錄活化主受缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）調(diào)節(jié)，并保持其mRNA的穩(wěn)定性2。因此，以HIF-1和VEGF為靶點的基因治療將為有效抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成提供新途徑。我們以RNA干擾為基礎(chǔ)，采用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法，研究HIF-1小片段干擾性RNA（small interference RNA，siRNA）對缺氧誘導的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型視網(wǎng)膜中HIF-1蛋白質(zhì)的表達及視網(wǎng)膜

12、新生血管形成的抑制作用。    1材料和方法    1.1材料 C57BL/6J小鼠由中國科學院上海實驗動物中心提供。脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000（LF2000）和Trizol均購自美國Invitrogen公司。FITC-Dextran 購自美國sigma公司。山羊抗鼠HIF-1抗體購自美國Santa Cruz公司。根據(jù)人類基因庫中人HIF-1基因（NM_001530）的mRNA序列設(shè)計siRNA作用靶點，其靶序列為AAGAGGTGGATATGTCTGG （12141232）?；瘜W合成64nt的s

13、hHIF-1（HIF-1小發(fā)夾RNA）寡核苷酸序列并退火形成雙鏈模板。采用Hind 和Bgl 雙酶切pSUPER.retro空載體質(zhì)粒，然后與退火形成的雙鏈模板體外連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選等步驟后抽提HIF-1 siRNA重組質(zhì)粒，并命名為pSUPERsiHIF-1。并測序鑒定重組質(zhì)粒中shHIF-1寡核苷酸插入序列的準確性。    1.2方法 采用Smith 等3的氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管動物模型。將18只出生7d后(P7)的C57BL/6J小鼠及其母鼠置于密閉的氧艙，溫度控制在（21±1），艙內(nèi)通入100 %濕潤的醫(yī)用氧氣，用CYS-I型數(shù)字測氧

14、儀測量氧艙的氧氣體積分數(shù)，每6h一次，控制氧氣體積分數(shù)(750±20)mL/L，5d后(P12) 回到正常氧環(huán)境，氧氣體積分數(shù)為(200±10)mL/L，制作缺氧誘導的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，并隨機分為對照組（B組）、空載體組（C組）和基因治療組（D組），每組6只。另取6只正常的P19 C57BL/6J小鼠作為對照（A組）。在小鼠出艙的前1d，向空載體組（C組）小鼠玻璃體腔注射空載體質(zhì)粒（pSUPER.retro）-脂質(zhì)體復合物共1L；基因治療組（D組）小鼠注射HIF-1 siRNA重組質(zhì)粒（pSUPERsiHIF-1）-脂質(zhì)體復合物共1L。注射完后立即放回氧艙，1d后小鼠

15、重新出艙。對照組小鼠不作轉(zhuǎn)染。            作者：熊宇夏曉波許惠卓蔣劍宋偉濤劉雙珍許雪亮【摘】目的：探討缺氧誘導因子-1（HIF-1）特異性小片         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。   

16、60;1.2.1視網(wǎng)膜 FITC-dextran熒光造影從各組中隨機取出19d齡（P19）小鼠2只，以100 mL/L水合氯醛(5mL/kg)ip麻醉小鼠后,打開胸腔,抽取配置的FITC-Dextran (50mg:1mL蒸餾水,10 000 rpm)1mL,用25G 1mL注射器灌注左心室后,迅速摘除眼球, 置于40g/L多聚甲醛20min。在便攜式顯微鏡下，沿角鞏膜剪開眼球,去除角膜、晶狀體，用自制玻璃棒小心娩出視網(wǎng)膜，放射狀剪開，置于干凈載玻片上，鋪平，滴20g/L明膠一滴,蓋上蓋玻片，置于Olympus BX50熒光顯微鏡下，采用激發(fā)光波長490nm及濾過波長520nm觀察并比較視網(wǎng)膜

17、血管形態(tài)的變化，同時照相。    1.2.2視網(wǎng)膜HIF-1蛋白質(zhì)的表達 采用鏈親和素（streptavidin，SP）法檢測視網(wǎng)膜中HIF-1的表達。4組各剩余4只小鼠于出艙后2h，經(jīng)10g/L戊巴比妥鈉30mg/kg ip麻醉后摘除眼球，40g/L多聚甲醛固定過夜，梯度酒精脫水，浸蠟，石蠟包埋，切片方向與視軸相平行，連續(xù)切片的厚度為6m，每只眼球隨機取出4張切片，常規(guī)脫蠟至水，滴加30g/L H2O2于切片上10min，阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS沖洗 3min×3次，放入枸櫞酸鹽緩沖液中（PH6.0）95修復15min，滴加試劑A（山羊血

18、清工作液）室溫封閉10min，加一抗（1100山羊抗鼠HIF-1抗體）4過夜，次日PBS沖洗3min×3次，滴加試劑B（生物素標記的兔抗羊）室溫10min, PBS沖洗3min×3次，滴加試劑C（辣根酶標記的鏈霉卵蛋白素工作液）室溫10min，PBS沖洗3min×3次，DAB顯色5min，自來水沖洗，蘇木素復染30s，脫水透明后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察4組小鼠視網(wǎng)膜中HIF-1的表達差異，在細胞核中發(fā)現(xiàn)棕色顆粒判定為陽性表達。    2結(jié)果    2.1視網(wǎng)膜FITC-dextr

19、an熒光造影A組P19小鼠視網(wǎng)膜血管基本成熟,自視盤發(fā)出的血管向四周呈放射狀均勻分布，直至視網(wǎng)膜周邊部，有些在周邊部仍較粗，形成沿周邊部視網(wǎng)膜走行的弓形血管。視網(wǎng)膜血管交叉成網(wǎng)狀，分深淺兩層，淺層血管較細，呈分支狀；深層血管較粗，呈網(wǎng)狀。B、C組P19小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)和分布發(fā)生了明顯變化，視網(wǎng)膜大血管不規(guī)則擴張，走行迂曲，中周部大片無灌注區(qū)，可見新生血管叢，伴熒光滲漏。D組P19小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基本可見，血管迂曲及不規(guī)則擴張較B、C組明顯減輕，無灌注區(qū)及新生血管叢明顯減少，視網(wǎng)膜血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基本正常（圖1）。    2.2視網(wǎng)膜HIF-1的表達

20、在正常視網(wǎng)膜組織中（A組）HIF-1蛋白表達陰性；在高氧誘導的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型（B組）及空載體注射組（C組）視網(wǎng)膜中HIF-1蛋白質(zhì)主表達在神經(jīng)節(jié)細胞層（陽性）；基因治療組（D組）HIF-1蛋白在神經(jīng)節(jié)細胞層的表達呈弱陽性，較B、C組明顯減少（圖2）。    3討論    新生血管形成是個極其復雜的病理生理過程，它涉及血管內(nèi)皮細胞的活化、增殖、遷移，血管管腔形成等。一些生長因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 、血栓反應素1、色素上皮分離因子（PEDF）、bFGF、TGF-、一氧化氮（NO）、基質(zhì)金屬蛋白酶家族

21、（MMPs）等均參與了新生血管的形成。缺氧誘導因子-1(HIF-1)是機體在低氧環(huán)境下啟動對低氧產(chǎn)生適應性反應的關(guān)鍵物質(zhì)，通過與HRE結(jié)合,誘導其下游基因VEGF的表達增強，在缺血性視網(wǎng)膜新生血管的形成中發(fā)揮著重的作用4。由l20kDa的亞基和91/93/94kDa的亞基組成，其中HIF-l是主的功能亞基，HIF-1的活性主是由HIF-l的蛋白質(zhì)水平和活性決定的;而亞基則屬于結(jié)構(gòu)亞基。在血管的發(fā)育過程中,HIF-1對血管新生也起重作用5,它是VEGF的轉(zhuǎn)錄活化因子,通過轉(zhuǎn)錄活化編碼VEGF基因而刺激血管新    圖 1 FITC-Dextran熒光照影視

22、網(wǎng)膜鋪片 A：A組P19小鼠視網(wǎng)膜血管基本成熟,自視盤發(fā)出的血管向四周呈放射狀均勻分布，交叉成網(wǎng)狀，分深淺兩層，淺層血管較細，呈分支狀；深層血管較粗，呈網(wǎng)狀；B，C：B、C組P19小鼠視網(wǎng)膜大血管不規(guī)則擴張，走行迂曲，中周部大片無灌注區(qū)，可見新生血管叢，伴熒光滲漏；D：D組P19小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基本可見，血管迂曲及不規(guī)則擴張較B、C組明顯減輕，無灌注區(qū)及新生血管叢明顯減少，視網(wǎng)膜血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基本正常        圖 2 小鼠視網(wǎng)膜HIF-1蛋白質(zhì)的表達差異（SP×400） A：A組P12小鼠視網(wǎng)膜

23、中HIF-1蛋白表達陰性；B，C：B、C組HIF-1蛋白表達呈陽性，主表達在神經(jīng)節(jié)細胞層；D：D組HIF-1蛋白表達明顯減少。    生6。因此, HIF-1也被稱為VEGF的管家轉(zhuǎn)錄因子。缺乏 HIF-1的表達, VEGFmRNA水平顯著降低;即使在缺氧條件下, VEGFmRNA也未被誘導表達7。Ozaki等8在缺氧建立的缺血性視網(wǎng)膜病變的小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜內(nèi)HIF-1水平于缺氧2h時達最高峰，缺氧24h時HIF-1水平回到基線水平，而VEGF于缺氧6h后在內(nèi)核層表達增強,且持續(xù)增高數(shù)十天，表明對于缺血性視網(wǎng)膜病變HIF-1水平的增加與VEGF

24、表達的增強在時間和空間上密切相關(guān)，HIF-1介導的VEGF上調(diào)在缺血性視網(wǎng)膜病變的發(fā)展中起著重作用。Masuda等9發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒包裹于脂質(zhì)體中，轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜24h開始表達；因此，本試驗選擇HIF-l為靶點，在小鼠出氧艙前1d向小鼠玻璃體腔注射HIF-1 siRNA重組質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物，旨在揭示當HIF-l處于高峰表達時，pSUPERsiHIF-1對其及視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用。    RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達的監(jiān)控機制。研究顯示，dsRNA通過兩種機制抑制細胞蛋白質(zhì)的合成。第一種為非特異性途徑，大于30bp

25、的雙鏈RNA進入細胞后可以激活干擾素應答系統(tǒng)，從而活化RNA依賴的蛋白激酶，乃至廣泛抑制細胞蛋白質(zhì)合成。第二種為特異性途徑，外源性或內(nèi)源性dsRNA在細胞內(nèi)被一種RNA酶-Dicer結(jié)合，隨即被切割成2123核苷酸的短鏈RNA，即小片段干擾RNA（small interferingRNA, siRNA）10。siRNA與Dicer結(jié)合形成RISC復合體 (RNA induced silencingcomplex)，siRNA作為引導序列，識別靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，并引導RISC復合體與mRNA結(jié)合，核酸酶Dicer將mRNA切割成2123nt的片段，從而特異性地抑制靶基因的表達。而新產(chǎn)生的雙

26、鏈RNA可再次形成RISC復合體，繼續(xù)降解mRNA，從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應，引發(fā)“基因沉默”。 基于對siRNA研究的不斷深入及其在抑制視網(wǎng)膜血管新生方面的潛在價值，本研究構(gòu)建了HIF-1的siRNA質(zhì)粒，旨在通過基因沉默下調(diào)視網(wǎng)膜HIF-1的表達,進而使其下游基因VEGF表達降低，從而抑制視網(wǎng)膜新生血管。            作者：熊宇夏曉波許惠卓蔣劍宋偉濤劉雙珍許雪亮【摘】目的：探討缺氧誘導因子-1（HIF-1）特異性小片    &

27、#160;    本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    在本實驗中，正常組視網(wǎng)膜未見明顯HIF-1蛋白陽性表達，說明在常氧條件下, HIF-1 由結(jié)構(gòu)中的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域(ODD) 控制,并通過泛素- 蛋白酶體途徑迅速降解11。缺氧2h后，對照組和空載體組視網(wǎng)膜HIF-1蛋白呈陽性表達，主表達于節(jié)細胞的胞核。這可能是節(jié)細胞層對組織缺氧最敏感,而HIF-1在缺氧的細胞內(nèi)積聚

28、,并與HIF-1形成二聚體,通過HIF-1C 末端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域(C-TAD) 誘導輔激活蛋白CBP/ P300 從胞漿進入胞核,共同形成大分子復合物,并與缺氧反應基因的缺氧反應元件( HRE) 上的HIF-1 結(jié)合位點(5- TACGTG-3) 結(jié)合,促進缺氧反應基因的轉(zhuǎn)錄,引起細胞對缺氧的一系列適應性反應12。當pSUPERsiHIF-1轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜后，HIF-1蛋白合成明顯受抑制,胞核顯棕色的細胞數(shù)量及程度明顯減少，且視網(wǎng)膜新生血管受到明顯抑制。因而證實了HIF-1 siRNA能有效抑制HIF-1的表達和視網(wǎng)膜新生血管的形成；另一方面HIF-1 siRNA在缺氧環(huán)境中亦能發(fā)揮RNA干擾效應

29、。我們通過體外重組HIF-1特異性siRNA，采用玻璃體注射途徑，有效地下調(diào)了視網(wǎng)膜HIF-1蛋白質(zhì)的表達，以及抑制了視網(wǎng)膜新生血管的形成，因而為有效抑制眼內(nèi)新生血管的形成提供了新的途徑。但是如何選擇高效基因表達系統(tǒng)，提高轉(zhuǎn)染效率及安全性，以達到眼內(nèi)新生血管的徹底根除等相關(guān)問題尚待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1 Boyd SR, Tan D, Bunce C, Gittos A, Neale MH, Hungerford JL, Charnock-Jones S and Cree IA. Vascular endothelial growth factor is elevated in ocula

30、r fluids of eyes harbouring uveal melanoma:identification of a potential therapeutic window. Br J Ophthalmol ,2002;86(4):448-4522 Mousa SA, Lorelli W, Campo chiaro PA.Role of hypoxia and extracellular matrix integrin binding in the modulation of angiogenic growth factors secretion by retinal pigment

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33、 disrupted by deletions and missense mutations. Proc Natl Acad Sci USA ，2000;97(9):4748-47536 Keck PJ, Hauser SD, Krivi G, Sanzo K,Warren T, Feder J,Connolly DT.Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. Science ,1989;246 (4935):1309-13127 Vincent KA, Shyu KG, Luo Y, Magner M, Tio RA, Jiang C,Goldberg MA, Akita GY, Gregory RJ, Isner JM.Angiogenesis is induced in a rabbit model of hin