攜帶人白細(xì)胞介素10和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子雙基因的重組腺病毒載體構(gòu)

1、攜帶人白細(xì)胞介素10和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子雙基因的重組腺病毒載體構(gòu)建與鑒定         11-03-23 15:53:00     編輯：studa20                  作者：邱紅, 朱月蓉, 邢繼成, 江淑芳 蘇長(zhǎng)青, 曹祥榮 方琳 【摘要】  目的： 構(gòu)建攜帶

2、人白細(xì)胞介素10(hIL10)和人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hHGF)雙基因的重組腺病毒載體。方法： 分別以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得hIL10和hHGF基因片段，與pIRES連接成為hIL10IREShHGF，測(cè)序正確后酶切，與pDC315連接，獲得穿梭質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF，與腺病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生重組腺病毒hIL10hHGF，PCR鑒定后，擴(kuò)增病毒，并測(cè)定病毒滴度。用重組腺病毒轉(zhuǎn)染BEL7402和WRL68細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)上清液中hIL10和hHGF的含量。結(jié)果： 成功構(gòu)建了重組腺病毒hIL10hHG

3、F，擴(kuò)增純化后測(cè)得重組腺病毒滴度為1×109 pfu/ml,轉(zhuǎn)染BEL7402和WRL68細(xì)胞72 h后，表達(dá)hIL10的量分別為(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml,表達(dá)hHGF的量分別為(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml。結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究AdhIL10hHGF在動(dòng)物體內(nèi)抗肝炎、肝纖維化作用奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  白細(xì)胞介素10; 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子; 腺病毒載體Abstract Objective: To construct the

4、recombinant adenovirus vector carrying human interlerkin10(hIL10) and human hepatocyte growth factor(hHGF).Methods： We amplified hIL10 and hHGF genes by PCR with plasmids pDC316hIL10EGFP and pCDNA3hHGF, respectively, and subcloned into pIRES to generate hIL10IREShHGF. Confirmed by sequence analysis,

5、 the hIL10IREShHGF genes were inserted into the vector pDC315, then the shuttle plasmid pDC315hIL10IREShHGF was constructed, which was cotransfected with the adenovirus skeleton plasmid into 293 cells to obtain the recombinant adenovirus vector hIL10hHGF. After identified the target genes by PCR, th

6、e recombinant adenovirus was propagated and the viral titer was determined. hIL10 and hHGF proteins in the virusinfected BEL7402 and WRL68 cells were measured by ELISA. Results： We obtained recombinant adenovirus vector of hIL10hHGF successfully. After propagation, the titer of the recombinant adeno

7、virus was 1×109 pfu/ml. The recombinant adenovirus could express hIL10 and hHGF in BEL7402 and WRL68 cells effectively. The concentrations of hIL±5.2) pg/ml and(350.6±12.4) pg/ml respectively, and the concentrations of hHGF were(20 827.1±345.5) pg/ml and(201.6±10.1) pg/ml re

8、spectively. Conclusion： The recombinant adenovirus vector hIL10hHGF seted the foundation for the gene therapy of hepatitis and cirrhosis in animals.Key words interlukin10; heptocyte growth factor; adenovirus vector 肝炎、肝炎后肝硬化嚴(yán)重危害人類健康，通過(guò)基因治療手段來(lái)預(yù)防和減輕肝損傷是近年來(lái)人們研究的一個(gè)新方向。IL10是一個(gè)多效性細(xì)胞因子, 具有廣泛的生物學(xué)作用。研究表明內(nèi)源性I

9、L10 對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用，而且給予外源性IL10 也顯示了明顯的抗肝細(xì)胞損傷作用1,2。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)被認(rèn)為是最強(qiáng)的肝再生促進(jìn)劑，是一種具有多功能的生物大分子，它有強(qiáng)效的抗肝炎、促肝再生作用3,4。本研究擬構(gòu)建人IL10和HGF雙表達(dá)的重組腺病毒hIL10-HGF，為腺病毒介導(dǎo)IL10及HGF基因治療肝炎、預(yù)防肝損傷建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材 料1.1.1 質(zhì)粒和菌株 含HGF基因的質(zhì)粒pCDNA3HGF由江蘇省人民醫(yī)院血液科惠贈(zèng)，含hIL10基因的質(zhì)粒pDC316EGFPhIL10,pIRES,pDC315,pDC

10、312,大腸埃希菌菌株Top10、腺病毒骨架質(zhì)粒、腺病毒包裝細(xì)胞HEK293細(xì)胞和肝癌BEL7402、正常肝臟WRL68細(xì)胞均由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。1.1.2 酶類和主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Taq DNA聚合酶、Pyrobest DNA,DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物、蛋白酶K購(gòu)自Takara公司;DMEM購(gòu)自Gibco BRL公司;DMSO為Amresco公司產(chǎn)品;胎牛血清購(gòu)自杭州四季清公司，56滅活30 min;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司;0.22 m無(wú)菌濾器及濾膜購(gòu)自Millipore公司;膠回收純化試劑盒及質(zhì)粒提取

11、試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司，引物由上海生工公司合成。1.2 方 法1.2.1 PCR法擴(kuò)增目的基因 以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF為模板，hIL10上下游引物5端分別引入NheI和EcoRI的位點(diǎn)，上游引物P1：5CGGCTAGCACCATGCACAGCTCAGCACTGC3;下游引物P2：5GAGAATTCTCAGTTTCGTATCTTC3;HGF上下游引物5端分別引入Xba和Sal酶切位點(diǎn)，P3：5GCTCTAGAACCATGTGGGTGACCAAACTC3;下游引物P4：5GAGTCGACCTATGACTGTGGTAC 3; 94預(yù)變性5 min，然后94變性30

12、 s，58退火30 s，72延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72連續(xù)延伸7 min。擴(kuò)增完畢后進(jìn)行膠回收獲得目的片段。1.2.2 測(cè)序質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 Nhe,EcoR和Xba,Sal分別酶切pIRES及目的片段，割膠回收純化，用T4 DNA連接酶與hIL10,hHGF連接，片段載體=31(摩爾比)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)，涂布于含50 mg/L氨芐西林的LB瓊脂平板，37,220 r/min恒溫?fù)u床振搖16 h。抽提質(zhì)粒，30 l ddH2O溶解。取10 l抽提質(zhì)粒和載體pDC312分別用Nhe,Sal酶切，產(chǎn)物電泳，割膠回收hIL10IREShHGF片段和線性化載體pDC312，T4

13、DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。取鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒12 l送上海生工公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pDC312hIL10IREShHGF。1.2.3 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 Nhe、Sal酶切pDC312hIL10IREShHGF，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，回收產(chǎn)物，30 l ddH2O溶解，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)，與含50 mg/L氨芐西林的LB瓊脂平板篩選，挑取20個(gè)最小克隆接種至2 ml LBAmp+(50 g/ml)液體培養(yǎng)基，37，220 r/min恒溫?fù)u床振搖過(guò)夜，取菌液進(jìn)行菌液電泳，選出可疑陽(yáng)性的菌株進(jìn)行PCR鑒定，確定含2 200 bp和540

14、bp條帶后，選兩個(gè)陽(yáng)性菌株進(jìn)行大量擴(kuò)增，采用堿裂解法抽提質(zhì)粒，獲得pDC315hIL10IREShHGF。1.2.4 腺病毒的包裝、鑒定及擴(kuò)增 2 g質(zhì)粒和2 g腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，37 5%CO2培養(yǎng)57 d，細(xì)胞病變，-80、37水浴凍融5次收集病毒，再次感染HEK293細(xì)胞，最終收集的PBS重懸病毒上清，PCR鑒定，分別以含目的基因的重組穿梭質(zhì)粒、重組腺病毒及不含目的基因的重組腺病毒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件同“1.2.1”，鑒定后-80分裝保存。重組腺病毒命名為AdhIL10hHGF。1.2.5 TCID50法滴定重組腺病毒效價(jià) 10%的培養(yǎng)液調(diào)整HEK293細(xì)胞為1×105個(gè)/ml，接種至96孔板，100 l/孔，培養(yǎng)24 h;分別加入10-110-12濃度的病毒，留最后兩孔加入無(wú)血清培養(yǎng)基作為對(duì)照孔，每