反相高效液相色譜法測定絞股藍(lán)50％總皂苷提取物中蘆丁和槲皮素

1、反相高效液相色譜法測定絞股藍(lán)50總皂苷提取物中蘆丁和槲皮素的含量             作者：盧金清， 喻樊， 田耀平， 肖波， 陳黎， 徐玉婷， 詹曉蓮 【關(guān)鍵詞】  絞股藍(lán)50%總皂苷提取物；,蘆?。?槲皮素；,反相高效液相色譜法,摘要：目的建立絞股藍(lán)50%總皂苷提取物中蘆丁與槲皮素的含量測定方法。方法采用高效液相色譜儀，使用TURNER KromasilTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相為0.4%磷酸水溶液甲醇乙腈進(jìn)行梯

2、度洗脫，流速為0.5 mlmin-1，檢測波長為360 nm；柱溫為40。結(jié)果蘆丁在0.373.70 g范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，r=0.999 9。槲皮素在0.050.50 g范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，r= 0.999 9；蘆丁的平均加樣回收率為99.2%，RSD為1.69%；槲皮素的平均加樣回收率為99.1%，RSD為2.21%。結(jié)論該方法簡便快捷，準(zhǔn)確度高。論文論文參考網(wǎng) 關(guān)鍵詞：絞股藍(lán)50%總皂苷提取物；  蘆??；  槲皮素；  反相高效液相色譜法 Determination of Rutin and Quercetin in 50% Total Gypeno

3、side Extraction of Gynostemma by RPHPLCAbstract：ObjectiveTo determine the main flavonoids rutin and quercetin in 50% total saponins of Gynostemma by RPHPLC. MethodsThe separation was performed on TURNER KromasilTMC18 column（250 mm×4.6 mm，5 m），the mobile phase consisted of 0.4% phosphoric acid-

4、methanol-acetonitrile，with the following rate of 0.5 mlmin-1at 40，the wavelength for measurement was 360 nm.ResultsThe calibration curves were linear in the range of 0.373.70 g for rutin (r=0.999 9)and in the range of 0.050.50 g for quercetin (r=0.999 9).The average recovery of compound rutin was 99

5、.2%(RSD=1.69%),and that of compound quercetin was 99.1% (RSD=2.21%).ConclusionThis method is accurate and reproducible. Key words：50% Total saponins of Gynostemma;  Rutin;   Quercetin;   RPHPLC    絞股藍(lán)(Gynostemma)又名七葉膽，是葫蘆科絞股藍(lán)屬植物。該屬植物我國有14種和3變種1?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，絞股藍(lán)具有抑制

6、腫瘤、防止衰老、降低血脂、增強(qiáng)免疫力、鎮(zhèn)靜止痛、保護(hù)心臟和肝臟等作用2。絞股藍(lán)50%總皂苷提取物是總皂苷含量達(dá)50%的、一種適用于口服制劑生產(chǎn)的原料藥，它具有很廣的應(yīng)用范圍，故本文采用反相高效液相色譜法，可對絞股藍(lán)50%總皂苷提取物中的蘆丁、槲皮素等成分進(jìn)行有效的分離和準(zhǔn)確的含量測定，并且操作簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能為建立絞股藍(lán)50%總皂苷提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。1  儀器與試藥DIONEXP680高效液相色譜儀（四元泵、Chromeleon色譜工作站、UVD170U檢測器），AT201電子分析天平（d=0.01 mg，瑞士），蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號00

7、809705）、槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號0819003）；甲醇（色譜純，天津大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站）、乙腈（色譜純，天津大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站），其它試劑均為分析純，水為雙蒸水。絞股藍(lán)原50%總皂苷提取物由湖北中醫(yī)學(xué)院中藥制劑教研室提供。2  方法與結(jié)果2.1  色譜條件色譜柱為TURNER KromasilTM（4.6 mm×250 mm，5 m）；以0.4%磷酸水溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，以乙腈為流動相C；按表1進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為360 nm；流速為0.5 mlmin-1，柱溫為40。理論板數(shù)按蘆丁、槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜

8、圖見圖14。表1  梯度洗脫（略）圖1   蘆丁對照品HPLC圖譜（略）圖2  槲皮素對照品HPLC圖譜（略）圖3  絞股藍(lán)50%總皂苷提取物供試品的HPLC圖譜（略）圖4   空白溶劑圖譜（略）2.2  供試品溶液的制備   取本品0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，精密量取20 ml，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2.3 

9、0; 對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.368 mg的溶液，即得蘆丁對照品溶液；精密稱取槲皮素對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.054 8 mg的溶液，即得槲皮素對照品溶液。2.4   標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取蘆丁、槲皮素對照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 l，注入液相色譜儀，測定峰面積值，結(jié)果見表1，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁的回歸方程為：y = 61.194 5x + 1.100  4，r=0.999 9；槲皮素的回歸方程為：y = 129.036 0X0.833 4

10、，r=0.999 9。線性范圍：蘆丁為0.373.70 g；槲皮素為0.050.50 g。論文論文參考網(wǎng) 圖5   蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）圖6   槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）2.5   精密度實(shí)驗(yàn)  取2.3項(xiàng)下蘆丁和槲皮素對照品溶液各5 l，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，結(jié)果見表23。蘆丁和槲皮素的RSD分別為：0.08%和0.26%。表2   蘆丁精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表3  槲皮素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.6   穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)  取2.2項(xiàng)下樣品溶液室溫放置0，3，6，9，1

11、2，24 h后測定，結(jié)果見表45，測得蘆丁和槲皮素峰面積基本不變，RSD分別為1.77%，2.80%，表明樣品溶液在24h之內(nèi)穩(wěn)定。表4   蘆丁穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表5   槲皮素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.7   重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，照2.2項(xiàng)下的方法依法制備，測定樣品中蘆丁和槲皮素的含量，結(jié)果見表67。測得蘆丁和槲皮素含量的分別為0.955%和0.222%，RSD分別為1.29%和1.71%。2.8  加樣回收實(shí)驗(yàn)  取已知含量的本品粉末6份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入一定量的蘆丁、槲皮素對照品

12、，按2.2項(xiàng)下的方法依法制備，按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表89。蘆丁加樣回收率為99.6%，RSD為1.07%，槲皮素加樣回收率為99.1%，RSD為2.21%。2.9   樣品測定 按2.2項(xiàng)下方法配制樣品溶液5份，依法測定，結(jié)果見表10。表6   蘆丁重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表7   槲皮素重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表8   蘆丁加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表9   槲皮素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（略）表10   5批絞股藍(lán)藥材中蘆丁、槲皮素含量測定結(jié)果（略）3  討論3.1

13、60;  提取方法的選擇  在絞股藍(lán)原藥材蘆丁、槲皮素的含量測定中，我們曾對不同極性的提取溶劑（如：不同濃度的甲醇、不同濃度的乙醇）和不同的提取方式（如：超聲、回流等）進(jìn)行過考察，并對提取時間進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，綜合考慮以石油醚回流提取，除去脂溶性較大的成分，再以甲醇回流提取3 h實(shí)際工資效果最好。3.2  檢測波長的選擇 在檢測波長選擇中根據(jù)對蘆丁對照品、槲皮素對照品溶液紫外光譜的測定，在360 nm處有最大吸收，最終選擇測定波長為360 nm。3.3   流動相的選擇流動相的選擇曾使用過乙腈-水、乙腈-甲醇-水、甲醇-水、乙腈-0.4%磷酸等流動相進(jìn)行等度及梯度洗脫，由于干擾峰難以分離，最后根據(jù)分離情況選擇了表1中的流動相。絞股藍(lán)50%總皂苷提取物色譜圖中除蘆丁、槲皮素的色譜峰外還有其他的色譜峰，分離度也較好，亦可以作為指紋圖譜用于絞股藍(lán)50%總皂苷提取物的鑒別。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，此方法能對絞股藍(lán)50%總皂苷提取物中的蘆丁、槲皮素進(jìn)行有效的分離和準(zhǔn)確的含量測定，并且操作簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性