凍化療對G422膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及調(diào)控機(jī)制的影響

1、凍化療對g422膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及調(diào)控機(jī)制的影響【關(guān)鍵詞】 誘發(fā)腫瘤細(xì)胞 膠質(zhì)瘤 分子機(jī)制 tunel染色【摘要】 目的:觀察冷凍聯(lián)合5-fu對g422膠質(zhì)瘤化療敏感性的影響，并探討其內(nèi)在的分子機(jī)制。方法:建立g422膠質(zhì)瘤動物模型，隨機(jī)分組，分別施以化療、冷凍、凍化療;tunel法用于觀察各組在不同時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡的變化;免疫組化方法檢測冷凍后p27kip1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:冷凍與化療均能引起腫瘤細(xì)胞凋亡，凍化療的聯(lián)合應(yīng)用使凋亡率明顯增加。冷凍中心區(qū)少有p27kip1的陽性表達(dá)，凍后周邊區(qū)表達(dá)大為增加。凍后凋亡細(xì)胞與p27kip1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(p0.01) 。結(jié)論:冷凍能夠提高g422膠質(zhì)

2、瘤對5-fu的化療敏感性，其發(fā)生機(jī)制可能與凍后p27kip1誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān);凍化療的聯(lián)合應(yīng)用較單純冷凍或化療治療惡性膠質(zhì)瘤效果更為明顯。膠質(zhì)瘤發(fā)病率高，術(shù)后易復(fù)發(fā)，手術(shù)切除結(jié)合放、化療效果仍不滿意，凍化療的聯(lián)合應(yīng)用作為一種腫瘤治療模式雖已有報道1，但其深入研究的報道較少。本研究利用g422膠質(zhì)瘤載體模型初步探討冷凍對其化療敏感性的影響及其內(nèi)在的分子機(jī)制。1材料與方法1.1瘤株的來源及動物模型的建立g422膠質(zhì)瘤株由北京市神經(jīng)外科研究所提供。健康昆明小鼠(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所,動物合格證號：01-3001)200只，周齡8周，體重1822 g，雌雄不限。取生長11 d的皮下瘤源，用生理

3、鹽水將其研磨成瘤細(xì)胞懸液(13)，細(xì)胞濃度在6.5106個/ml，取0.1 ml細(xì)胞懸液分別接種于小鼠后下肢肌腹內(nèi)。1.2.1實驗分組：待腫瘤生長至第9天，直徑約2 cm，隨機(jī)將動物分組：對照組50只;實驗組150只，其中單純化療組、單純冷凍組和凍化療組各50只。冷凍、化療、凍化療實施后各組于6 h、12 h、24 h、48 h、72 h每時間點(diǎn)各10只。1.2.2冷凍實施：單純冷凍組用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后切開瘤旁皮膚，暴露腫瘤，用直徑約5 mm探頭(lcs-3000型冷凍治癌機(jī)，美國產(chǎn))插入腫瘤中心，凍后90 s后自然復(fù)溫(探頭溫度為-180 );單純化療組：經(jīng)腹

4、腔注射5-氟尿嘧啶(5-fu，18 mg/kg，上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn));凍化療組：冷凍實施與單純冷凍組同，凍后5 min即經(jīng)腹腔注射5-fu(18 mg/kg);對照組未經(jīng)任何處理。每組于各時間點(diǎn)處死動物切取瘤塊按不同檢測要求保存標(biāo)本。1.3細(xì)胞凋亡的原位檢測4%多聚甲醛灌注固定標(biāo)本，石蠟包埋，4 m厚的切片作tunel染色，檢測細(xì)胞凋亡，按原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(boehring mannheim, germany)說明進(jìn)行。凋亡細(xì)胞核為棕黃顆粒染色，用裝有目鏡網(wǎng)格測微尺的光鏡(400)計算凋亡細(xì)胞數(shù)(個/0.0625 mm2)。1.4免疫組化染色4 m厚的石蠟切片，58 烤片45 m

5、in，脫蠟入水，微波抗原修復(fù)，滴加一抗?jié)舛葹閜27kip1多抗(santa cruz公司)1100， 4 孵育過夜，sp藥盒染色(sp-9001，北京中山)。p27kip1陽性表達(dá)為胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒沉著，400倍光鏡下每張切片計數(shù)單位視野陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)百分比，至少計算1 000個細(xì)胞，陽性細(xì)胞所占比率為p27kip1蛋白表達(dá)的百分?jǐn)?shù)。1.5統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以xs表示，采用spss 10.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。對冷凍后p27kip1蛋白表達(dá)及凋亡細(xì)胞采用pearson相關(guān)性分析。2結(jié)果2.1tunel染色結(jié)果凋亡細(xì)胞出現(xiàn)胞核和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有特征性的改變;冷凍后腫瘤的凍

6、心區(qū)以大片非特異性淺黃色壞死為主，冷凍周邊區(qū)凋亡細(xì)胞增多，單純化療后凋亡細(xì)胞散在或灶狀分布;凍化療聯(lián)合組除具有單純冷凍后凋亡細(xì)胞分布特點(diǎn)外，遠(yuǎn)離凍心的周邊區(qū)凋亡也大為增多，其各時點(diǎn)tunel陽性細(xì)胞數(shù)顯著多于其它各組;對照組僅有少量凋亡細(xì)胞散在分布。各組不同時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡的變化見表1。 表1 各組不同時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡的變化2.2p27kip1蛋白表達(dá)p27kip1蛋白表達(dá)位于胞核呈棕黃色染色，對照組p27kip1陽性細(xì)胞比較均勻分布于腫瘤組織中，單純化療組與對照組比有顯著性差異;實施局部冷凍后，冷凍中心幾乎沒有陽性表達(dá)，凍周區(qū)于凍后24、48、72 h表達(dá)明顯增多，凍化療后周邊區(qū)各時間點(diǎn)p27k

7、ip1蛋白表達(dá)增加更為明顯。冷凍和5-fu對p27kip1蛋白表達(dá)的影響見表2。表2 冷凍和5-fu對p27kip1蛋白表達(dá)的影響(2.3 p27kip1蛋白表達(dá)與凋亡細(xì)胞數(shù)相關(guān)性分析經(jīng)pearson相關(guān)性分析表明，冷凍后p27kip1蛋白表達(dá)與凋亡細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(p0.01)。3討論研究表明冷凍使膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生凝固性壞死的同時，也可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡2，以往的觀點(diǎn)認(rèn)為，冷凍能夠提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)5-fu藥物濃度，其原因與凍后血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接暫時開放、血管通透性增加有關(guān)3。本試驗發(fā)現(xiàn)化療藥5-fu可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，冷凍誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用比5-fu更明顯，凍化療的聯(lián)合應(yīng)用顯著提高了腫瘤細(xì)胞

8、的凋亡率。p27kip1是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，于1994年polyka等3在研究細(xì)胞抑制的機(jī)理時發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子-和接觸性抑制處理的細(xì)胞中存在一種分子量為27 kd的細(xì)胞周期抑制蛋白，它能與cyclin-cdk2和cyclin-cdk4復(fù)合物緊密結(jié)合，即為p27蛋白。p27kip1蛋白具有限制性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，其水平隨著細(xì)胞周期進(jìn)程的改變而改變，p27kip1能廣泛抑制各種周期素和cdk的活性使細(xì)胞周期停滯在g1期。p27kip1除了通過影響細(xì)胞周期的進(jìn)程來干擾細(xì)胞的增殖外，其水平的高低還與細(xì)胞凋亡的發(fā)生有密切關(guān)系。fujisda等4發(fā)現(xiàn)：p27kip1的過度表達(dá)在許多腫瘤中，

9、都可以引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并在hl-60細(xì)胞中，p27參與了神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡4。本研究發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，單純化療組p27kip1蛋白表達(dá)增加，單純冷凍后6、12、24、48、72 h 27kip1蛋白表達(dá)均明顯增多，凍化療后周邊區(qū)各時間點(diǎn)p27kip1蛋白表達(dá)增加更為明顯。另外，本組相關(guān)性研究表明，腫瘤凋亡細(xì)胞數(shù)與p27kip1蛋白在凍后表達(dá)的變化呈正相關(guān)(p0.01)，而p27kip1對細(xì)胞凋亡的調(diào)控主要依賴蛋白水平，說明p27kip1蛋白的過度表達(dá)參與了化療和冷凍誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本實驗同時發(fā)現(xiàn)p27kip1蛋白表達(dá)變化趨勢與凋亡同步，我們推測冷凍通過誘導(dǎo)p27kip1蛋白的高表達(dá)觸發(fā)細(xì)胞凋亡，最終使冷凍聯(lián)合5-fu通過凋亡途徑殺傷腫瘤細(xì)胞的能力顯著增加。冷凍后的p27kip1蛋白表達(dá)變化是二者聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同殺瘤效應(yīng)的內(nèi)在分子基礎(chǔ)。本試驗觀察到冷凍與5-fu聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高g422膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率，并嘗試對其