5.2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段導(dǎo)學(xué)案

1、課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段導(dǎo)學(xué)案學(xué)習(xí)目標(biāo)：1、了解PCR技術(shù)的基本操作。2、理解PCR的原理。3、討論P(yáng)CR的應(yīng)用?；A(chǔ)知識(shí)PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過(guò)程，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程類(lèi)似：1細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析：條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DNA聚合酶打開(kāi)DNA雙螺旋催化合成DNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3端起點(diǎn)2細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程的解析：解旋： 引物結(jié)合：DNA聚合酶結(jié)合： 子鏈合成： 后續(xù)加工： 子鏈合成特點(diǎn)： 思考DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？3 DNA分子復(fù)制的人工

2、控制解開(kāi)螺旋：在 時(shí)，DNA雙螺旋打開(kāi)，形成兩條DNA單鏈，稱(chēng)為變性?；謴?fù)螺旋：在 左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為復(fù)性。復(fù)制條件： 反應(yīng)場(chǎng)所： （自動(dòng)溫度周期性調(diào)節(jié)）。思考緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？（核基質(zhì)）4PCR的反應(yīng)過(guò)程變性：在 時(shí)DNA解旋 復(fù)性：在 時(shí)引物與DNA單鏈結(jié)合延伸：在 時(shí)合成DNA子鏈（兩個(gè)引物間的序列）實(shí)驗(yàn)操作（1） PCR反應(yīng)體系：緩沖液、 ， 、 、兩種RNA引物，水（2） 實(shí)驗(yàn)操作步驟按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液；將PCR反應(yīng)體系50L用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL）中；將微量離心管放到PCR儀中；設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。24 水浴法：將微型離心管依次在 、 、 的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時(shí)間。3實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（1）避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。（2）緩沖液和酶分裝成小份，20低溫保存。（3）每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器的槍頭。（4）混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過(guò)程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放