QIA58細胞增殖檢測試劑盒使用說明書_Merck

1、 Calbiochem ®BrdU Cell Proliferation Assay目錄號 QIA58別 稱 :Bromodeoxyuridine Assay包裝大小 包裝大小:200/1000次反應形式 形式:96孔板檢測 檢測方法 方法 方法:比色法儲 存 :將整個試劑盒保存在-20°C非無霜冰箱中。使用前 使用前:1. 使用前將固定劑/變性劑溶液取出室溫下放置至少 4個小時,因冷凍而形成的沉淀會重新溶解在溶 液中。2. 用合適體積的 1×PBS重溶過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG。 對于 200次反應的試劑盒,將過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG 重溶于 125

2、µl的 1X PBS溶液中。使用 此稀釋液作為進一步稀釋的儲液。 對于 1000次反應的試劑盒,將過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG 重溶于 250 µl的 1X PBS溶液中。使用 此稀釋液作為進一步稀釋的儲液。將稀釋液在室溫下放置至少 10分鐘(或者直到溶液變得清澈。然后將其分裝后儲存在-20°C的非 無霜冰箱中。一旦 一旦試劑 試劑 試劑盒內(nèi)地 盒內(nèi)地 盒內(nèi)地組 組 分被融化 分被融化: BrdU標記物和 100×抗 BrdU 抗體以及過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG 都應該被分裝并保存在-20°C的非無霜冰箱中,避免反復凍融。 試劑盒的其他組

3、分(包括底物,一抗稀釋液,二抗稀釋液,20×洗板溶液,固定劑/變性劑溶液,終 止液應該被保存在 4°C。適用范 適用范圍 圍 :Calbiochem® BrdU Cell Proliferation Assay基于 BrdU 摻入到增殖細胞內(nèi)新合成的 DNA 鏈中的原理, 是非同位素的細胞增殖免疫測定方法,該方法靈敏、快速、易于操作。背景 背景:一種非同位素依賴的細胞增殖免疫測定方法細胞增殖檢測在許多科學領域檢測中都是必需的,測量細胞進入 S 期后3H thymidine的摻入量一直 是傳統(tǒng)的細胞增殖檢測方法。接下來用閃爍技術法或放射自顯影來定量摻入的3H thy

4、midine的含量。 這種方法有以下一些缺點,包括:費時,費力,需要操作和處理放射性同位素以及需要昂貴的檢測設 備。因此,很多研究者開始采用并確立起另一種代替3H摻入法的細胞增殖檢測方法。在這種方法中, 溴化脫氧尿苷(BrdU,一種 thymidine 的相似物替代了3H thymidine。在處于活躍增殖期的細胞 中,BrdU 被摻入到新合成的 DNA 鏈中。將 DNA 雙鏈部分變性后,BrdU 的含量也可用免疫方法檢測出來, 從而可以確定處于 DNA 合成活躍期的細胞的數(shù)目。Calbiochem® BrdU Cell Proliferation Assay檢 測法包括將 BrdU

5、 摻入到平板上的細胞中,然后利用細胞層作為固相支持物免疫檢測 BrdU。該方法靈 敏、快速、易于操作并且可以應用于高通量樣品檢測。此外,除了評估細胞增殖外,細胞數(shù)目,形態(tài) 和細胞抗原分析信息也可以同時從一個培養(yǎng)板中獲得。檢測 檢測原理 原理 原理:Calbiochem® BrdU Cell Proliferation Assay檢測法包括將 BrdU 摻入到平板上的細胞中,然后利用 細胞層作為固相支持物免疫檢測 BrdU。在培養(yǎng)的最后 2到 24個小時內(nèi),將 BrdU 加入到培養(yǎng)孔中。 BrdU 將會被摻入到處于分裂期的細胞內(nèi)。為了使抗體能夠與摻入的 BrdU 結(jié)合,細胞必須固定,穿

6、膜 和 DNA 變性。這些操作僅需用固定劑/變性劑溶液一步處理即可完成。然后將一抗抗 BrdU 抗體加入到 孔內(nèi)孵育 1小時,使其結(jié)合摻入的 BrdU。多余的抗體被洗去后,加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二 抗使其與一抗結(jié)合。辣根過氧化物酶可以催化發(fā)色底物 tetra-methylbenzidine(TMB從無色溶液轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色溶液(當加 入終止液后變?yōu)辄S色,溶液的顏色深度與摻入到細胞中的 BrdU 的量成正比。這些反應后溶液的顏色 深度可以用分光光度計精確測量。試劑 試劑盒 盒 組 分 :BrdU Cell Proliferation Assay試劑盒有 200次反應和 1000次反應兩種包裝。

7、 BrdU標記物(試劑盒組分貨號 JA1595-50UL:一種 10,000×的 BrdU 溶液。 固定劑/變性劑溶液(試劑盒組分貨號 JA1598-25ML 100×抗 BrdU 一抗(試劑盒組分貨號 JA1604-100ML:一抗儲液。 一抗稀釋液(試劑盒組分貨號 JA1604-100ML:一抗稀釋液。 過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠 IgG(試劑盒組分貨號 JA1618-50UG:凍干粉,請參照“使用前”部分 中重溶。 二抗稀釋液(試劑盒組分貨號 JA1615-100ML:用來稀釋重溶的過氧化物酶偶聯(lián)羊抗鼠二抗。 底物(試劑盒組分貨號 JA1608-100ML:Tetra-m

8、ethylbenzidine溶液。 20×濃縮洗板液(試劑盒組分貨號 JA1617-100ML:20×濃縮 PBS 和表面活性劑溶液。含有 2%的 chloroacetamide。 反應終止液(試劑盒組分貨號 JA1616-24ML:摩爾濃度 2.5N 的硫酸。注意事 注意事項 項 和操作建 和操作建議 議 : 不要將試劑過度暴露在光照下。 操作時戴手套和防護眼鏡。 不要將不同試劑盒中的同種組分混合使用。 不要用嘴吸或者吞咽試劑盒中任何組分。 緩沖液和試劑中含有抗菌和殺真菌的試劑,請注意不要直接接觸這些組分。 不要在操作時或者在操作的區(qū)域吸煙,進食或喝水。 人類樣本可能會被

9、有感染性的試劑污染,不要吞咽,暴露傷口或者吸入懸浮物。適當處置樣本。具體操作 具體操作步驟 步驟 步驟:1. BrdU Cell Proliferation Assay提供足夠用于 200次(或 1000次96孔板檢測的試劑。由于細 胞水平上個體反應的差別,檢測時需要做平行孔。所有移液操作都要使用新的一次性槍頭和容器,避 免產(chǎn)生試劑或樣本的交叉污染。2. 向 96孔板中的每孔接種 100 µl 1-2×105細胞/ml的細胞。如果檢測的時貼壁細胞,在使用檢測 藥品(比如增殖誘導劑或抑制劑處理前,給予細胞時間貼壁生長。需要設立兩種對照保證實驗結(jié)果的可信度和準確性:I. 空白對

10、照:只加入組織培養(yǎng)基(不含細胞II. 背景對照:接種細胞但不加入 BrdU 標記物。按照如下第 6步以后實驗流程平行操作。3. 將 BrdU 標記物按照 1:2000的比例稀釋于新鮮的培養(yǎng)基中,作為標記物工作儲液。4. 每孔細胞中加入 20 µl標記物工作儲液。5. 在細胞培養(yǎng)箱中孵育 2-24小時,使 BrdU 摻入到細胞中。6. 如果使用的是非貼壁細胞,將 96孔板 1000rpm 離心 10分鐘。7. 倒置培養(yǎng)板移除培養(yǎng)液,并在吸水紙上輕靠吸取殘余培養(yǎng)液。8. 每個孔中加入 200 µl固定劑/變性劑溶液。9. 室溫孵育 30分鐘。10. 倒置培養(yǎng)板移除反應液,在吸水

11、紙上輕靠吸取殘余反應液。此步驟后培養(yǎng)板可在 4°C存放 1星期。11. 將 100×的抗 BrdU 抗體稀釋在一抗緩沖液中(例如,120 µl抗 BrdU 抗體稀釋在 12 ml抗體稀釋 液中。每孔中加入 100 µl該稀釋后的溶液并室溫孵育 1小時。12. 將 25 ml的 20×濃縮洗板液加入到 475 ml去離子水中,混合菌與,制備成 1×的工作緩沖液。13. 用自動洗板機或手工清洗平板 3遍,清洗時保證每個孔中都裝滿了清洗緩沖液。同樣將平板倒置 并輕靠吸水紙吸去殘余清洗液。14. 將重溶于 1×PBS中的過氧化物酶偶

12、聯(lián)羊抗鼠 IgG 稀釋于二抗稀釋液中并用 0.2微米濾膜過濾。注 意:二抗的稀釋比例根據(jù)具體情況而定。參考儲存管上的標簽確定稀釋比例。15. 每孔中加入 100 µl該溶液,室溫孵育 30分鐘。16. 用自動洗板機或手工清洗平板 3遍,清洗時保證每個孔中都裝滿了清洗緩沖液。同樣將平板倒置 并輕靠吸水紙吸去殘余清洗液。17. 用去離子水洗板,操作同 16。18. 每孔中避光加入 100µl底物溶液,室溫反應 15分鐘。19. 按照加入底物的順序向每孔內(nèi)加入 100µl反應終止液。20. 用 96孔板分光光度計測量不同孔在 450-540(或 450-595nm 雙波

13、長的吸光值。反應終止 30分 鐘內(nèi)必須完成測量讀數(shù)。示例 示例:PMA(phorbol ester或 RA(retinoic acid可以刺激前髓細胞 HL-60分化,分化的 HL-60細胞在 培養(yǎng)基中失去了增殖的能力。為了展示如何使用 BrdU Cell Proliferation Assay試劑盒檢測這兩種 藥物對 HL-60細胞的劑量效應,向 96孔板中每孔接種 2×104個細胞(2 X 105細胞/ml,并用不同 濃度的 PMA 或 RA 處理 24小時(37°C, 7% CO2。加入 BrdU 標記物,繼續(xù)孵育 24小時。用 BrdU Cell Prolifera

14、tion Assay法檢測摻入的 BudU。檢測發(fā)現(xiàn) HL-60細胞脫離正常細胞周期時的藥物濃度 與骨髓成熟相關。在另一個系列實驗中,BrdU Cell Proliferation Assay法檢測到引起貼壁和非貼 壁細胞靜息的 thymidine 和 PMA 的劑量。同時也進行了基于 PMA 處理 HL-60細胞實驗的藥物動力學/敏 感度研究。用 20 ng/ml的 PMA 處理后,不同濃度的 HL-60細胞都出現(xiàn)了生長抑制。24小時后,分別 將細胞與 BrdU 標記物混合孵育 24,18或 2小時,并用 BrdU Cell Proliferation Assay法檢測摻入 的 BrdU 的

15、量。在所有的標記時間內(nèi),信號強度和處于增殖狀態(tài)的細胞數(shù)目都直接相關。除了一個例外, 處于擴增期的細胞的檢測信號強度都遠遠高于背景對照(無 BrdU和空白對照(無細胞。160個細 胞/孔,2小時 BrdU 孵育實驗組的信號強度并不遠遠高于空白對照。相似的結(jié)果也在 Daudi 細胞株和 HT1080細胞株中發(fā)現(xiàn)。我們利用兩個不同的細胞株比較了 BrdU Cell Proliferation Assay(目錄貨號 QIA58檢測法與競 爭對手同類產(chǎn)品的檢測靈敏度。BrdU Cell Proliferation Assay在所有的 BrdU 標記時間組都顯示出 更強的靈敏度(增殖細胞信號/無細胞組信號

16、。在許多不同的系統(tǒng)中,BrdU 標記 24小時組和 BrdU 標記 2小時組都檢測到了增殖細胞。圖 1 PMA引起的細胞生長抑制PMA 引起的細胞生長抑制。每孔接種 2×104個 HL-60細胞后用不同濃度的 PMA 刺激。孵育 24小時 后,加入 BrdU 標記 18小時,然后按照操作步驟中描述進行檢測。 圖 2 RA引起的細胞生長抑制RA 引起的細胞生長抑制。每孔接種 2×104個 HL-60細胞后用不同濃度的 PMA 刺激。孵育 24小時后, 加入 BrdU 標記 18小時,然后按照操作步驟中描述進行檢測。 圖 3 細胞增殖水平檢測用不同劑量的可以引起細胞生長抑制的藥物 PMA 或 thymidine 處理貼壁細胞(A431和 MCF-7和非貼 壁細胞(HL-60和 Jurkat后檢測細胞增殖水平。不同細胞濃度,不同 BrdU 標記時間增殖與非增殖 HL-60細胞的藥物響應。 圖 4 增殖與非增殖 HL-60細胞的反應不同細胞濃度,不同 BrdU 標記時間增殖與非增殖 HL-60細胞的藥物響應。 圖 5 非貼壁細胞的檢測靈敏度非貼壁細胞株的檢測靈敏度:BrdU標記 2小時,1000個 Daudi 細胞即可以與背景區(qū)分 開來,而 BrdU 標記 24小時,100個 Daudi 細胞可以與背景區(qū)