實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離課件

1、實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗1：大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離微生物包括哪五類：微生物包括哪五類：真菌真菌原生生物原生生物特點：特點：結構簡單結構簡單, ,形體微小形體微小. .通常要用光學顯微鏡或通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構. .且且體內(nèi)一般不含有葉綠素體內(nèi)一般不含有葉綠素. .不能進行光合作用不能進行光合作用. . 原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界一、基礎知識： (一)微生物實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離大腸桿菌（E.coli）分布：人和哺乳動物腸道，此外還廣泛分布于水、

2、分布：人和哺乳動物腸道，此外還廣泛分布于水、 污水、土壤、谷類、乳制品等當中。污水、土壤、谷類、乳制品等當中。大腸桿菌在人體的大腸桿菌在人體的_中一般對人體無害，但任何中一般對人體無害，但任何大腸桿菌如果進入大腸桿菌如果進入_都會對人體產(chǎn)生危害。都會對人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌是大腸桿菌是_工程中被廣泛采用的工具。工程中被廣泛采用的工具。腸道腸道泌尿系統(tǒng)泌尿系統(tǒng)基因基因革蘭氏革蘭氏_（填陰或陽）性菌（填陰或陽）性菌陰陰代謝類型：代謝類型：異養(yǎng)，兼性厭氧型異養(yǎng)，兼性厭氧型生長適宜溫度：生長適宜溫度：質(zhì)粒、質(zhì)粒、EcoREcoR限制酶、限制酶、 E.coli-DNAE.coli-DNA連接酶、連接酶、

3、 受體細胞受體細胞3737左右左右實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離細菌的代謝類型 n自養(yǎng)型細菌自養(yǎng)型細菌n異養(yǎng)型細菌異養(yǎng)型細菌: :光合自養(yǎng)型光合自養(yǎng)型:化能自養(yǎng)型化能自養(yǎng)型:大部分腐生菌和寄生菌大部分腐生菌和寄生菌如藍細菌如藍細菌如硝化細菌如硝化細菌1、同化作用類型、同化作用類型2、異化作用類型、異化作用類型需氧型細菌需氧型細菌厭氧型細菌厭氧型細菌兼性厭氧型細菌兼性厭氧型細菌大多數(shù)細菌大多數(shù)細菌如破傷風桿菌如破傷風桿菌如酵母菌、大腸桿菌。如酵母菌、大腸桿菌。大腸桿菌屬于異養(yǎng)、兼性厭氧型細菌大腸桿菌屬于異養(yǎng)、兼性厭氧型細菌實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離大腸桿菌大腸桿菌酵母菌酵母菌放線菌放線菌 霉菌霉菌菌

4、落：菌落：單個或少數(shù)細菌單個或少數(shù)細菌在在固體固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基上大量生長繁殖時，所上大量生長繁殖時，所形成的肉眼可見的具有一定形形成的肉眼可見的具有一定形態(tài)結構的態(tài)結構的子細胞群體子細胞群體。不同微生物形成的菌落具有不同不同微生物形成的菌落具有不同的特征，的特征，是鑒定菌種的重要依據(jù)是鑒定菌種的重要依據(jù)。如菌落的大小、形狀、邊緣、光澤度、顏色、透明度等。如菌落的大小、形狀、邊緣、光澤度、顏色、透明度等。菌落的概念菌落的概念白色或乳白色，光滑白色或乳白色，光滑大腸桿菌菌落：大腸桿菌菌落：實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠有些細菌在一定的條件下，細胞里

5、面形成一個橢圓形的休眠體，叫做體，叫做芽孢芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3 3小時以后才小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌. .實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離一、基礎知識：一、基礎知識：（二）培養(yǎng)基（二）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配

6、制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（1 1）按物理狀態(tài)分：）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基和和液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基基、半固體培養(yǎng)基。（2 2）按功能分：）按功能分：選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基和和鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基。（3 3）按成分分：）按成分分：天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基和和合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基。1.1.培養(yǎng)基的類型和用途培養(yǎng)基的類型和用途實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：表面生長表面生長均勻混濁生長均勻混濁生長沉淀生長沉淀生長實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分

7、離半固體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基：無動力無動力 有動力有動力( (彌散彌散) )( (是否運動是否運動) ) 實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基: : 分離酵母菌、霉菌等真菌分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: : 分離金黃色葡萄球菌分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基不加氮源的無氮培養(yǎng)基: : 分離固氮菌分離固氮菌 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: : 分離自養(yǎng)型微生物分離自養(yǎng)型微生物 加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: : 分離導入了目的基因的受體細胞分離導入了目的基因的受體細胞

8、加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)基: : 分離雜交瘤細胞分離雜交瘤細胞實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離天然培養(yǎng)基有血清、天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸（如雞胚和牛胚浸液）。液）。優(yōu)點：優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好培養(yǎng)效果好缺點：缺點：來源受限來源受限; ;成分成分復雜，影響對某些實復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗驗產(chǎn)物的提取和實驗結果的分析結果的分析; ;易發(fā)生支易發(fā)生支原體污染原體污染; ; 根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模種類和數(shù)量，用人工方法模擬

9、合成的。擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。物質(zhì)。 優(yōu)點：優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定和含量相對固定; ;成本低成本低 缺點：缺點： 缺少某些成分，缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長不能完全滿足體外細胞生長需要。需要。 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基: :天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離血清中含有：血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）鐵蛋白等）多種金屬離子；多種金屬離子； 激素；激素；促貼附物質(zhì)，如纖

10、粘蛋白、冷析促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。球蛋白、膠原等。各種生長因子各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白轉(zhuǎn)移蛋白不明成分不明成分 人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離培養(yǎng)基的用途培養(yǎng)基的用途液體培養(yǎng)基：增菌，液體培養(yǎng)基：增菌，常用于發(fā)酵工業(yè)常用于發(fā)酵工業(yè)固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：增菌，菌種保存及分離純化、增菌，菌種保存及分離純化、鑒定菌落、活菌計數(shù)等鑒定菌落、活菌計數(shù)等半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種

11、實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH2 2、成分、成分水、碳源、氮源、水、碳源、氮源、 無機鹽、生長因子無機鹽、生長因子( (生長因子即細菌生長必需，而自身不能合成的生長因子即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物化合物, ,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) )真菌：真菌：5 56 6 細菌：細菌：6.5 6.5 7.5 7.5 有時會加一定量的氯化鈉以維持一定的滲透壓有時會加一定量的氯化鈉以維持一定的滲透壓實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離1.1.無菌操作的概念無菌操作的概念 無菌操

12、作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止防止_污染的方法。污染的方法。四、無菌操作四、無菌操作_必須無菌、必須無菌、_也必須要無菌、也必須要無菌、_時不能帶入其他雜菌時不能帶入其他雜菌主要包括：主要包括：雜菌雜菌2.2.消毒與滅菌消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別的概念及兩者的區(qū)別 消毒：消毒：使用使用較溫和理化因素較溫和理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)，僅殺死物體表面或內(nèi)部的部的一部分一部分對人體有害的微生物的過程。對人體有害的微生物的過程。不能殺死不能殺死芽孢和孢子。芽孢和孢子。滅菌：滅菌：使用使用強烈的理化因素強烈的理化因素消滅物體內(nèi)外消滅物體內(nèi)外所有所有微生微生

13、物，包括芽孢和孢子。物，包括芽孢和孢子。各種器具各種器具培養(yǎng)基培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移菌種轉(zhuǎn)移菌種實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離比較消毒與滅菌比比較較項項理化因理化因素的素的作用作用強度強度消滅微消滅微生物生物的數(shù)的數(shù)量量芽孢和芽孢和孢子孢子能否能否被消被消滅滅消消毒毒滅滅菌菌較為溫和較為溫和部分生活狀態(tài)部分生活狀態(tài)的微生物的微生物不能不能能能全部微生物全部微生物強烈強烈實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌）（濕熱滅菌）灑精燈灼燒滅菌灑精燈灼燒滅菌干熱滅菌干熱滅菌（1 1）滅菌方法：）滅菌方法：3 3、常用的滅菌和消毒的方法、常用的滅菌和消毒的方法培養(yǎng)基、無菌水、培養(yǎng)基、無菌水、各種耐高

14、溫的玻璃金屬器具各種耐高溫的玻璃金屬器具100kPa100kPa、121 121 下維持下維持15-30min15-30min需要保持干燥需要保持干燥耐高溫的玻璃金屬器皿耐高溫的玻璃金屬器皿160-170 160-170 下加熱下加熱1-2h1-2h接種環(huán)等金屬器具接種環(huán)等金屬器具實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3 3、化學藥劑消毒法、化學藥劑消毒法: :用用75%75%

15、酒精、新潔爾酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒滅等進行皮膚消毒; ;氯氣消毒水源氯氣消毒水源4 4、紫外線消毒、紫外線消毒(2)消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒與滅菌的方法常用的消毒與滅菌的方法實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。如果需要，請選擇合適的方法。（1 1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2 2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管玻棒、試管、燒瓶和吸管（3 3） 實驗操作者的雙手實驗操作者的雙手答：（答：（1 1）、（）、（2 2）需要滅菌；（）需要滅菌；（3 3）

16、需要消毒。）需要消毒。實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離（一）制備（一）制備LBLB培養(yǎng)基（通用的細菌培養(yǎng)基）培養(yǎng)基（通用的細菌培養(yǎng)基）1 1、配方：蛋白胨、配方：蛋白胨0.50.5克，酵母提取物克，酵母提取物0.250.25克，克，氯化鈉氯化鈉0.50.5克，水克，水50ml50ml（配固體培養(yǎng)基再加瓊脂（配固體培養(yǎng)基再加瓊脂1 1克）克）溶解溶解計算稱量計算稱量調(diào)調(diào)pHpH分裝分裝加塞，包扎加塞，包扎2 2、流程、流程二二 操作步驟操作步驟滅菌滅菌倒平板倒平板實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離分裝：分裝：注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，因此在注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，因此在將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到三角瓶或

17、試管中時必須用將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到三角瓶或試管中時必須用_。加塞加塞：試管用塑料蓋或：試管用塑料蓋或_；三角瓶口用；三角瓶口用_或或_封口封口, ,再用再用_或報紙封口?；驁蠹埛饪凇０喊河糜胈或報紙或報紙三角漏斗三角漏斗棉花塞棉花塞封口膜封口膜6 6層紗布層紗布牛皮紙牛皮紙牛皮紙牛皮紙高壓蒸氣滅菌法高壓蒸氣滅菌法滅菌滅菌1 1）加水：）加水： 2 2）裝鍋：）裝鍋： 向外層鍋內(nèi)加入適量的水，加水的要求是向外層鍋內(nèi)加入適量的水，加水的要求是_._.物品放置的要求物品放置的要求_：加蓋：將蓋上的加蓋：將蓋上的排氣軟管排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的插入內(nèi)層滅菌桶的_內(nèi)。內(nèi)。再以再以_方式同時旋緊相對的兩

18、個螺栓，使螺方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。栓松緊一致，勿使漏氣。不觸及內(nèi)膽不觸及內(nèi)膽整齊、穩(wěn)定、留出空隙整齊、穩(wěn)定、留出空隙排氣槽排氣槽兩兩對稱兩兩對稱實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離3 3）加熱排氣：）加熱排氣： 4 4）保溫保壓：）保溫保壓： 5 5）出鍋：）出鍋： 打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的_。_后，關上排氣閥。后，關上排氣閥。 當鍋內(nèi)壓力升到當鍋內(nèi)壓力升到_kg/cm_kg/cm2 2時，控制時，控制熱源，維持壓力至熱源，維持壓力至_min_min。 切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當壓切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當壓力降

19、至力降至_時，打開時，打開_，旋松螺栓，打開，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。蓋子，取出滅菌物品。冷空氣冷空氣待冷空氣完全排盡待冷空氣完全排盡0 01 11515排氣閥排氣閥否則會因鍋內(nèi)壓力較高，打開氣閥后造成的壓力差否則會因鍋內(nèi)壓力較高，打開氣閥后造成的壓力差可能使容器內(nèi)的培養(yǎng)基噴濺造成棉塞沾染培養(yǎng)基而可能使容器內(nèi)的培養(yǎng)基噴濺造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至使容器爆炸。發(fā)生污染，甚至使容器爆炸。滅菌后，通常將實驗用具放入滅菌后，通常將實驗用具放入6080 _6080 _中烘干，以除去滅菌時的水分，避免引起中烘干，以除去滅菌時的水分，避免引起_。烘箱烘箱污染污染實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離倒

20、平板倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至：待培養(yǎng)基冷卻至_ _ 時，將時，將每只培每只培養(yǎng)皿倒入養(yǎng)皿倒入_ml_ml未凝固的固體培養(yǎng)基，置未凝固的固體培養(yǎng)基，置于于_位置上，輕輕晃動使其均勻鋪滿平皿底位置上，輕輕晃動使其均勻鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面。部，待凝，使之形成平面。_備用。備用。制斜面制斜面：將未凝固的固體培養(yǎng)：將未凝固的固體培養(yǎng)基的試管基的試管_放，冷卻待凝使即放，冷卻待凝使即成為斜面。成為斜面。10101212水平水平倒置倒置斜斜倒平板、制斜面倒平板、制斜面操作平臺操作平臺：滅菌好的培養(yǎng)基和實驗器具置于超凈臺上打開滅菌好的培養(yǎng)基和實驗器具置于超凈臺上打開_和和_，滅菌，滅菌30min.3

21、0min.過濾風過濾風紫外線紫外線超凈臺超凈臺實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離思考題：思考題：A A、操作過程中避免帶入雜菌的方法有哪些？、操作過程中避免帶入雜菌的方法有哪些？1 1、滅菌后的培養(yǎng)基、器具置于超凈臺上，并打、滅菌后的培養(yǎng)基、器具置于超凈臺上，并打開超凈臺的紫外燈和過濾風，滅菌開超凈臺的紫外燈和過濾風，滅菌3030分鐘。分鐘。2 2、用鑷子夾出灑精棉球擦拭桌面和實驗者雙手。、用鑷子夾出灑精棉球擦拭桌面和實驗者雙手。3 3、整個操作在酒精燈火焰旁進行、整個操作在酒精燈火焰旁進行4 4、打開后或加塞前試管口、三角瓶口灼燒滅菌。、打開后或加塞前試管口、三角瓶口灼燒滅菌。B B、培養(yǎng)基滅菌后，

22、需要冷卻到、培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到6060后才倒平板，你后才倒平板，你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度呢？用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度呢？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。 實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離思考題思考題C C、為何要將平板倒置？、為何要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基面的水分更好地揮發(fā)，又可

23、以防止皿蓋上的水珠基面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落培養(yǎng)基，造成污染。落培養(yǎng)基，造成污染。 DD、在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在、在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？生物嗎？為什么？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。E E、如何檢查培養(yǎng)基是否受雜菌的污染？、如何檢查培養(yǎng)基是否受雜菌的污染？將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)，若無菌落產(chǎn)生

24、將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)，若無菌落產(chǎn)生則未受雜菌污染。則未受雜菌污染。實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離（二）液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)（二）液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)主要器具：主要器具：操作方法：操作方法：先將接種環(huán)進行先將接種環(huán)進行_滅菌滅菌, _, _后后的接種環(huán)挑取少量菌種，放入三角瓶的液體培養(yǎng)基的接種環(huán)挑取少量菌種，放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，加塞。置于中，加塞。置于_搖床振蕩培養(yǎng)小時。搖床振蕩培養(yǎng)小時。無菌操作：無菌操作：略略搖床搖床思考：如何冷卻接種環(huán)？思考：如何冷卻接種環(huán)？可通過接觸試管內(nèi)壁或未可通過接觸試管內(nèi)壁或未長菌的培養(yǎng)基達到冷卻的長菌的培養(yǎng)基達到冷卻的目的。目的。接種環(huán)、搖床等接種環(huán)、搖

25、床等灼燒灼燒冷卻冷卻實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離（三）平板劃線分離法（三）平板劃線分離法主要器具：主要器具：操作過程：操作過程：注意：注意：無菌操作方法：同前。無菌操作方法：同前。將培養(yǎng)皿將培養(yǎng)皿_（蓋在下），放于（蓋在下），放于_恒溫培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)_小時。小時。在作第二次以及其后的劃線操作時，要從在作第二次以及其后的劃線操作時，要從上一次劃線的開始上一次劃線的開始_劃線。劃線。接種環(huán)、接種環(huán)、思考：若如上圖所示進行劃線分離，則接種環(huán)總思考：若如上圖所示進行劃線分離，則接種環(huán)總共進行幾次灼燒滅菌？共進行幾次灼燒滅菌？恒溫培養(yǎng)箱。恒溫培養(yǎng)箱。每次劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌，再冷卻。每次

26、劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌，再冷卻。末端末端倒置倒置實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 平板劃線的操作方法平板劃線的操作方法交叉劃線法交叉劃線法連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法 實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 1.1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？接種環(huán)？ 操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次

27、劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個菌落。菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個菌落。2 2、在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？、在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？為什么？劃線結束后灼燒接種環(huán)，及時殺死接種環(huán)上殘留的劃線結束后灼燒接種環(huán)，及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離3.3.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？

28、在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。4.4.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。殖而來的菌落。5 5、如何判斷接種操作是否符合無菌要求

29、？、如何判斷接種操作是否符合無菌要求？如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求。接種過程中，無菌操作還未達到要求。實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離（四）（四）稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法主要器具：主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管玻璃三角刮刀、移液管或吸管操作過程：操作過程：先將培養(yǎng)菌液先將培養(yǎng)菌液稀釋稀釋（1010-5-51010-

30、7-7倍）倍）用移液管或吸管取用移液管或吸管取0.1ml0.1ml稀釋度不同的菌液，加稀釋度不同的菌液，加在平板上，用無菌玻璃三角刮刀均勻涂布在培養(yǎng)在平板上，用無菌玻璃三角刮刀均勻涂布在培養(yǎng)基平面上。基平面上。在適當稀釋度下在適當稀釋度下，可培養(yǎng)得到相互分，可培養(yǎng)得到相互分開的的菌落。開的的菌落。將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下），放于將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下），放于 恒溫培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小時。箱中培養(yǎng)小時。劃線分離方法簡單；涂布分離，易形成單菌落，劃線分離方法簡單；涂布分離，易形成單菌落，但操作復雜些。但操作復雜些。實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離10g10g土樣土樣從土壤中分離微生物從土壤中分離微生物稀釋涂

31、布法稀釋涂布法實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離（五）斜面接種及菌種保存（五）斜面接種及菌種保存主要器具主要器具：操作過程操作過程：在無菌操作下，用接種環(huán)挑取：在無菌操作下，用接種環(huán)挑取_菌落，菌落，再用劃線法再用劃線法（自斜面底部向上輕輕劃直線）接種接種在在_上，上， _恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)_小時小時后，后，_ _ 冰箱保存。冰箱保存。無菌操作無菌操作：同前：同前試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多, ,不容易不容易進入雜菌，同時能用來做純細菌的長期保存。進入雜菌，同時能用來做純細菌的長期保存。 思考：菌種保存為何采思考：菌種保存為何采用斜面而不是平板？用斜面而不是平板？接種環(huán)、恒溫箱、冰箱接種環(huán)、恒溫箱、冰箱單單斜面斜面實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 1 1、臨時保藏：、臨時保藏：接種到固體斜面培接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后養(yǎng)基，菌落長成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。 2 2、長期保存：、長期保存：甘油冷凍管藏法甘油冷凍管藏法