下載本文檔
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、 牛透明軟骨細(xì)胞與組織引導(dǎo)再生膠原膜 體外培養(yǎng)后植入體內(nèi)的研究 【摘要】目的解決修復(fù)重建組織器官缺損所需移植材料的問題,利用組織工程技術(shù),進(jìn)行組織工程牛透明軟骨的實驗研究。方法用分離獲得的牛軟骨細(xì)胞,與醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜體外聯(lián)合培養(yǎng)1周后,以軟骨細(xì)胞可降解材料復(fù)合物的形式植入裸鼠體內(nèi),8周后對所獲得的組織工程軟骨樣組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。結(jié)果在實驗獲得的組織工程軟骨樣組織中有軟骨細(xì)胞的存在,并且可以分泌硫酸軟骨素。證實為組織工程牛透明軟骨。結(jié)論實
2、驗結(jié)果表明應(yīng)用組織工程技術(shù),在體外進(jìn)行組織工程軟骨的制作,可能成為解決整形外科領(lǐng)域修復(fù)缺損用移植材料不足的方法之一?!娟P(guān)鍵詞】軟骨細(xì)胞醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜體外培養(yǎng)組織工程學(xué) A study on guided tissue regeneration and tissue engineering-transplantation of collagen membrane seeded with cultured hyaline chondrocytesSONG Yeguang, MA Haihuan, CAI Zhe, et al.Plastic Surgery Hospital, Chines
3、e Academy of Medical Sciences, Beijing 100041【Abstract】 Objective Lack of transplant material is a main problem in the repair and reconstruction of tissue or organ defects. To seek the succedaneum of transplants, we studied and used tissue-engineered growth hyaline cartilage.Methods The articular hy
4、aline cartilage obtained from newborn calf within 6 hours of sacrifice was enzymatically dissolved. The chondrocytes were then seeded onto the medical collagen membrane of guided tissue regeneration in a 24 well plate in RPMI1640 medium. One week later, the chondrocyte medical collagen membrane of g
5、uided tissue regeneration complex was implanted subcutaneously into the back of nude mice. Eight weeks after implantation, the animals were sacrificed.Results The present study seems to demonstrate that the cartilage-like tissue was strong enough to be transferred after being implanted for 8 weeks.
6、The cartilage-like tissue was proved to be tissue-engineered hyaline cartilage by HE stain. The chondrocytes could secrete chondroitin sulfate as proved by Lev-Spicer stain. Conclusion Tissue engineering technique was used to make tissue-engineered cartilage in vitro. It will provide a new transplan
7、t material for the repair of tissue or organ defects.【Key words】 Chondrocyte Guided tissue regeneration Culture in vitro Tissue engineering組織移植是整形外科修復(fù)和改善缺損組織器官的主要方法之一,但是,自體組織移植來源有限,免疫排斥和免疫抑制劑的副作用限制了異體組織的使用,其它合成及天然材料亦存有各種不足。80年代初組織工程學(xué)的開展,為尋求新的組織移植替代物開辟了新途徑。我們也嘗試?yán)媒M織工程技術(shù),進(jìn)行組織工程軟骨的培育,選擇細(xì)胞易分離、增殖能力強的新生牛透
8、明軟骨細(xì)胞,與醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜體外聯(lián)合培養(yǎng)后,植入裸鼠體內(nèi),觀察探求用組織工程軟骨,解決整形外科領(lǐng)域移植材料不足的可能性。1材料與方法1.1實驗材料1.1.1實驗動物裸鼠 BALB/c nu/nu, 8周齡,雄性(衛(wèi)生部藥物鑒定研究所、動物中心提供);新生小牛,日齡12h以內(nèi)(天津市奶牛研究所)。1.1.2醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜我們選擇醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所),作為體外細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料。1.1.3主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco);胎牛血清(天津市正江科技公司);膠原酶 型(Sigma);胰蛋白酶(Difico)。1.2實驗方法1.2.1軟
9、骨細(xì)胞分離根據(jù)Klagsbrun等1建立軟骨細(xì)胞分離方法。選用處死6h以內(nèi)的新生小牛肩關(guān)節(jié)面的透明軟骨,用含青霉素100U/ml,鏈霉素100g/ml和硫酸慶大霉素10g/ml的無鈣鎂磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌軟骨碎片,在培養(yǎng)皿中將軟骨碎片盡量切碎,用無鈣鎂磷酸鹽緩沖液洗滌2次,加入20ml含0.5%胰蛋白酶-0.3g/ml膠原酶溶液,4消化4h,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37消化1 h,用細(xì)胞過濾器過濾軟骨細(xì)胞懸浮液,加入含5%FCS Hanks 液20ml中止酶反應(yīng),然后繼續(xù)用5%FCS Hanks液洗滌2次,10%FCS RPMI 1640洗滌1次,用胎盤藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。1.2.2軟骨細(xì)胞培養(yǎng)用含有1
10、0%FCS、Vitam C 5 g/ml、青霉素100U/ml、鏈霉素100g/ml、慶大霉素10g/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液,將分離獲得的軟骨細(xì)胞懸浮至1×106/ml,取1ml軟骨細(xì)胞懸浮液接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)的1cm×1cm醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜上,置37CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng),每3天換液一次,710天內(nèi)將軟骨細(xì)胞-組織引導(dǎo)再生膜復(fù)合物移植至裸鼠體內(nèi)。1.2.3動物實驗在裸鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉0.1ml,待動物麻醉后,剪開背部皮膚,輕輕在皮下組織分離,將體外培養(yǎng)710天內(nèi)的軟骨細(xì)胞組織引導(dǎo)再生膜復(fù)合物,于無菌條件下置入裸鼠背部皮下,植入8周后,處死裸鼠取出新生組
11、織,對新生的組織工程軟骨樣組織的性質(zhì)、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行組織學(xué)檢測。1.2.4軟骨組織的組織學(xué)檢測對獲得的新生組織進(jìn)行軟骨細(xì)胞定性檢測。蘇木素-伊紅染色:將冰凍8m厚的組織切片充分風(fēng)干,于丙酮中固定30min,水洗3次,于蘇木素染液中染色10min,水洗3次;0.1mol/L鹽酸乙醇中洗5秒,返藍(lán)液(氨水pH8.0)中反應(yīng)5秒;伊紅染液中染色2min,水洗3次;分別用不同濃度的乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。Lev-Spicer染色法:將冰凍8m厚的組織切片充分風(fēng)干,于丙酮中固定30min,水洗3次,經(jīng)阿爾新藍(lán)染液40min染色,0.1mol/L鹽酸乙醇洗滌,不經(jīng)水洗,用濾紙吸干多余鹽酸,
12、分別用不同濃度的乙醇脫水,二甲苯透明中性樹膠封片。含硫酸粘液物質(zhì)呈藍(lán)色,非硫酸化酸性物質(zhì)不著色。其它呈復(fù)染。2結(jié)果2.1軟骨細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果以往軟骨組織工程學(xué)研究,廣泛使用的細(xì)胞培養(yǎng)支架為PGA,我們選用中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供的醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜代替PGA,加入細(xì)胞懸浮液后,鏡下觀察細(xì)胞均勻沉降于醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜表面,隨培養(yǎng)時間延長,細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。1周后醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜可見乳白色物質(zhì)。2.2大體解剖觀察結(jié)果移植術(shù)后8周,裸鼠皮下可見約0.5cm×1.0 cm大小新生組織塊,觸之微軟有彈性,可隨皮膚上下左右移動;解剖見新生組織塊為乳白色,組織表面有血管通過
13、,觸之有彈性。2.3組織學(xué)觀察結(jié)果利用蘇木素-伊紅染色,可觀察到新生組織內(nèi)的基質(zhì)呈堿性,軟骨細(xì)胞核呈藍(lán)染。其中可見同源軟骨細(xì)胞,軟骨囊不明顯(1)。Lev-Spicer染色顯示了新生組織中呈藍(lán)染的部分區(qū)域(2),表明軟骨細(xì)胞可以分泌硫酸軟骨素。1組織工程軟骨組織的蘇木素伊紅染色,其中可見同源軟骨細(xì)胞,軟骨囊不明顯×400Fig1Photomicrograph demonstration histology,using hematoxylin and eosin stain,tissue-engineered cartilage.The specimen is composed cho
14、ndrocytes and aldaline matrix.Nucli of the chondrocytes are stained in blue color and alkaline matric are stained in pink color×4002組織工程軟骨的阿爾新蘭染色,組織中呈藍(lán)染的部分為軟骨細(xì)胞分泌的硫酸軟骨素 ×400Fig2Lev-Spicer staining of tissue-engineered cartilage.Chondroitin sulfate is stained in blue color×4003討
15、論組織工程學(xué)的開展,為研究修復(fù)組織和器官缺損所致的功能障礙開辟了新途徑,自從Vacanti等2-4利用組織工程技術(shù)成功的再生了新生小牛透明軟骨后,組織工程學(xué)研究越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。國內(nèi)學(xué)者近年來從各個角度進(jìn)行了研究探討,劉彥春等5進(jìn)行了組織工程技術(shù)中細(xì)胞培養(yǎng)支架的研究,證實以卵磷脂和多聚賴氨酸共同包埋支架,使細(xì)胞均勻分布于支架纖維之間和支架表面,可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)揮正常功能。王為民等6進(jìn)行了用動物組織的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)替代人工合成ECM制作的實驗,證實經(jīng)處理后的動物組織僅剩肌腱、皮膚、軟骨和骨的膠原框架,動物實驗表明兔軟骨ECM,可以作為組織
16、填充物而長期存在并有較好的組織親和性和相容性,可以在體內(nèi)誘導(dǎo)軟骨膜細(xì)胞向其中生長而重建軟骨。張前法等7進(jìn)行了兔自體肌腱細(xì)胞與碳纖維體外聯(lián)合培養(yǎng)后的體內(nèi)植入實驗,結(jié)果表明體內(nèi)植入后肌腱細(xì)胞繼續(xù)增殖,并能合成I型膠原。軟骨組織是整形外科進(jìn)行組織修復(fù)與重建的理想材料,由于自體軟骨供區(qū)有限,因此,我們開展軟骨組織工程學(xué)的實驗研究,選用中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供的醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜作為細(xì)胞外基質(zhì),其主要材料為動物天然膠原蛋白,具有組織細(xì)胞誘導(dǎo)再生作用,其特有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有細(xì)胞網(wǎng)結(jié)聚集功能。我們的實驗結(jié)果表明,醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜可以作為軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)支架。將新生小牛肱骨關(guān)節(jié)面的透明軟
17、骨細(xì)胞-組織引導(dǎo)再生膠原膜復(fù)合物,植入裸鼠體內(nèi),8周后對從裸鼠體內(nèi)獲得組織工程軟骨樣組織進(jìn)行的組織學(xué)檢測,證實為組織工程牛透明軟骨。提示應(yīng)用組織工程技術(shù),以醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜作為軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)支架,可以在裸鼠體內(nèi)培育組織工程軟骨。但是,我們的實驗系統(tǒng)還將進(jìn)一步完善,以期從形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面整體還原軟骨組織,使在體外按照預(yù)先設(shè)計形態(tài),重建缺損組織移植物成為現(xiàn)實。作者單位:北京,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)整形外科醫(yī)院100041參考文獻(xiàn)1Klagsbrum M. Large-scale preparation of chondrocytes. Methods Enzymol, 1979
18、, 58:560-565.2 Vacanti CA, Kim W,Upton J, et al. Tissue-engineered growth of bone and cartilage. Transplantation Proceedings, 1993, 25:1019-1021.3 Kim WS, Vacanti JP, Cima L, et al. Cartilage engineered in predetermined shape employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymer. Plast Reconstr Surg, 1994, 94:233-237.4 Vacanti CA, Paige KT, Kim WS, et al. Experimental tracheal replacement using
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2024幼兒園教育集團股權(quán)收購與教育產(chǎn)業(yè)發(fā)展合作協(xié)議3篇
- 2024年酒吧經(jīng)營權(quán)承接合同
- 2024年集裝箱搬運吊裝合同6篇
- 2024年高端電子產(chǎn)品研發(fā)與銷售合同
- 2024年跨國技術(shù)授權(quán)與關(guān)鍵設(shè)備進(jìn)口合同樣本版B版
- 2024年適用出租車租賃承包協(xié)議版
- 2024年跨區(qū)域醫(yī)療機構(gòu)雙向轉(zhuǎn)診服務(wù)合作協(xié)議3篇
- 2024年軟件開發(fā)合同-軟件公司為客戶定制開發(fā)軟件
- 2025年度智能溫室大棚控制系統(tǒng)集成合同3篇
- 第16課-三國鼎立-作業(yè)課件-2020-2021學(xué)年部編版歷史與社會七年級上冊
- 湖北省襄陽市數(shù)學(xué)中考2024年測試試題及解答
- 2024中考語文《儒林外史》歷年真題專練(學(xué)生版+解析版)
- DB12T 1334-2024 養(yǎng)老機構(gòu)衛(wèi)生管理規(guī)范
- 工程項目審核現(xiàn)場踏勘記錄表
- YYT 0698.1-2011 最終滅菌醫(yī)療器械包裝材料 第1部分 吸塑包裝共擠塑料膜 要求和試驗方法
- 入職申請登記表(模板)
- 高考物理動量守恒定律試題(有答案和解析)
- 兒童運動發(fā)育的早期干預(yù)和康復(fù)
- 《道路交通安全法》課件
- 工作優(yōu)化與效益提升
- 電機教學(xué)能力大賽獲獎之教學(xué)實施報告
評論
0/150
提交評論