通過Blast數(shù)據(jù)庫對抗EGFR納米抗體、單克隆抗體 進行生物信息學分析

1、生物信息學作業(yè)通過Blast數(shù)據(jù)庫對抗EGFR納米抗體、單克隆抗體進行生物信息學分析 學 院（系）： 生命科學與技術(shù) 專 業(yè)： 生物化工 學 號： 學 生 姓 名： 完 成 日 期： 2015-11-14 一研究背景表皮生長因子受體（EGFR）是酪氨酸激酶受體（RTK）ErbB家族的一員。生長因子受體與EGF家族蛋白結(jié)合后，將會被激活。研究表明，EGFR參與許多不同種類的腫瘤產(chǎn)生及發(fā)展轉(zhuǎn)移的過程。EGFR蛋白在人類腫瘤細胞中過屬于表達蛋白，在體內(nèi)、體外實驗均表明，EGFR蛋白可以引起腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。EGFR作為藥物作用靶點也成為目前抗腫瘤分子靶向研究中關(guān)注最為廣泛、研究最為深入、最有前途的治療

2、靶點之一。目前，針對抗EGFR作用的研究主要集中在EGFR的單克隆抗體和旨在阻斷EGFR介導的信號轉(zhuǎn)導通路的小分子蛋白酪氨酸激酶抑制劑上。駱駝科動物體內(nèi)存在天然的缺失輕鏈的功能性抗體，此類抗體只含重鏈，克隆其可變區(qū)得到的僅含重鏈可變區(qū)的單域抗體稱為納米抗體。相較之傳統(tǒng)單克隆抗體高成本、低穩(wěn)定性等局限性，納米抗體分子量很小且缺少Fc段，不會引起人體的免疫反應，生物相容性好，具有很強的組織穿透能力，能夠進入致密的實體瘤組織，甚至能穿透血腦屏障發(fā)揮功效；而游離的納米抗體也能被人體迅速清除，在醫(yī)學領(lǐng)域具有得天獨厚的優(yōu)勢。本實驗室致力于通過基因工程學的方法表達抗表皮生長因子受體納米抗體（nanobody

3、 of pidermal growth factor receptor ，EGFRnb），從而捕獲腫瘤細胞，實現(xiàn)體內(nèi)腫瘤細胞的清除或是靶向給藥。本組目前使用的抗EGFR納米抗體PMP9G8序列為專利序列（附錄1），在構(gòu)建質(zhì)粒的過程中對基因序列進行了密碼子優(yōu)化（附錄2），對大腸桿菌密碼子偏好性進行分析，減少了密碼子兼并性。由于該種EGFR納米抗體為商品蛋白，對其結(jié)構(gòu)沒有詳盡的研究，所以在蛋白表達、純化的過程中存在一定的盲目性；在今后的研究中我們試圖對納米抗體進行基因突變后篩選以提高其親和力，但是因為沒有對氨基酸位點功能進行詳細的分析，所以突變位點的選擇也存在一定的盲目性。因此，本文試圖通過Bla

4、st序列比對為切入點，對納米抗體PMP9G8的結(jié)構(gòu)特點、功能位點、引物設(shè)計等方面進行分析。同時，選取專利CN200510024158.3.中的人源化EGFR單克隆重鏈抗體3C6序列(附錄3)，與鼠源胚系基因進行比對分析，加深對于基因重排機理的了解。圖1.EGFR結(jié)構(gòu)模式圖二 納米抗體PMP9G8序列比對分析將PMP9G8氨基酸序列輸入BlastP搜索框中，搜索結(jié)果顯示有12條高相似、全覆蓋的氨基酸序列。名為Chain B, Nanobody/vhh Domain 9g8 In Complex With The Extracellular Region Of Egfr的序列能夠與PMP9G8序列

5、100%覆蓋、且100%相似。這個序列能與EGFR胞外域結(jié)合形成復合體，由此可知納米抗體PMP9G8也具有與EGFR結(jié)合的能力。VHH-9g8 domain序列中共有130個氨基酸，前127個與目的納米抗體全部相同（圖2），所以通過VHH-9g8 domain對序列進行分析，能夠進一步了解納米抗體PMP9G8的結(jié)構(gòu)信息。圖2.納米抗體PMP9G8序列比對分析結(jié)果圖3.納米抗體 PMP9G8序列與VHH-9g8 domain序列比對結(jié)果圖4. VHH-9g8 domain序列信息組氨酸標簽 EGFR胞外域蛋白VHH-9g8 domain與EGFR的結(jié)合位點VHH-9g8 domain的N端VHH

6、-9g8 domain的C端圖5. VHH-9g8 domain與EGRF胞外域結(jié)合形成復合體的3D結(jié)構(gòu)VHH-9g8 domain序列來源為Lama，納米抗體序列也是從Lama體內(nèi)篩選得到的，兩者同源。由圖3可知，VHH-9g8 domain中含有8個折疊（圖中紅框標注），蛋白的N端1-8號氨基酸為折疊，納米抗體序列C端對應的是VHH-9g8 domain的第127號位，不在折疊區(qū)域內(nèi)，為無規(guī)則卷曲的形狀，比較自由。由3D結(jié)構(gòu)（圖4）可知，N端距離抗原結(jié)合位點比較近，所以在表達純化加入組氨酸標簽時不能夠加在N端，否則容易影響抗體活性。如圖顯示VHH-9g8 domain的6個組氨酸標簽也加在

7、了C端上（圖中綠框標注），所以在納米抗體PMP9G8純化時標簽也應該加在C端以保證活性。VHH-9g8 domain的第22位和第96位的兩個半胱氨酸形成內(nèi)部二硫鍵（圖中藍框標注），可以由此推測納米抗體序列也在這兩個位置上形成二硫鍵。這個二硫鍵對納米抗體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性至關(guān)重要，如果二硫鍵沒能形成或者正確折疊，蛋白將會形成包涵體而失活。因此基因突變篩選親和力更高的納米抗體時不能對這兩個位點進行突變。而VHH-9g8 domain的其他保守區(qū)域位點與納米抗體序列相同，因此在下文中將直接對納米抗體序列分析。三納米抗體蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果圖5.納米抗體PMP9G8保守結(jié)構(gòu)域分析如圖所示，分析結(jié)果預測該

8、納米抗體屬于免疫球蛋白超家族（Ig superfamily）,同時該納米抗體的特定比對分析結(jié)果顯示其與名為cd04981的人類重鏈抗體(IgV-H)顯示高度的相似性，因此在IgV-H保守位點中的一些特征氨基酸也體現(xiàn)在了該納米抗體序列中：1）在納米抗體蛋白序列中，29、43、47、95、117、118六個氨基酸在IgV-H保守位點中參與形成異質(zhì)二聚體接觸界面，是多肽結(jié)合位點。因此推測該二聚體可能也有類似性質(zhì)。在表達純化過程中要特別注意二聚體的形成，通過凝膠篩分等方法將二聚體去除；同時說明該納米抗體也可以與其他小分子進行連接，具有應用于靶向給藥的潛力。2）根據(jù)圖中特征可變區(qū)氨基酸的位置可以推測該納

9、米抗體的3個高度可變區(qū)CDR為24-32、72-78、114-116位氨基酸。原則上是納米抗體的可變區(qū)位點與抗原相結(jié)合，但是圖中顯示，位于框架區(qū)的第50位氨基酸也會結(jié)合抗原，而框架區(qū)主要決定了納米抗體的構(gòu)象，因此可以推測此種抗體的親和力與其構(gòu)象關(guān)系密切，因此在制備時要避免形成包涵體，破壞抗體的天然構(gòu)象，失去抗原結(jié)合能力。在后期進行納米抗體基因改造進時要尤其著重考慮第50位氨基酸突變可能會帶來的影響。3）圖中顯示PMP9G8序列的9、11、124、126、122位氨基酸參與抗體內(nèi)部結(jié)構(gòu)之間的相互作用，這幾個氨基酸也處于預測的框架區(qū)中。四利用Primer-Blast對納米抗體序列進行引物設(shè)計及特異

10、性分析 將本組經(jīng)過密碼子優(yōu)化的納米抗體基因序列輸入PCR Template中，將上游引物插入位點設(shè)置為基因1-50位，下游引物插入位點設(shè)置為基因300-385位。為了保證模板特異性，增加了引物對無關(guān)模板mismatches的數(shù)量，這樣與無關(guān)模板匹配的特異性不足的引物會被篩選出去。圖6. 增加引物的擴增特異性服務器計算后(如圖)，設(shè)計出了10對特異性非常強的引物，這些引物在擴增的過程中不會對其他非目的片段進行擴增。主要原因是因為本納米抗體序列經(jīng)過了密碼子優(yōu)化，針對宿主菌大腸桿菌的密碼子進行偏好分析,減少稀有密碼子促進表達的同時也減少了密碼子的兼并性，與序列其他基因片段差異明顯，因此設(shè)計出的引物可

11、以特異性識別固定的位點開始擴增，不會擴增錯誤位點。引物特異性很強圖7.納米抗體PMP9G8引物設(shè)計結(jié)果用未經(jīng)過密碼子優(yōu)化的EGFR單克隆抗體重鏈可變區(qū)序列3C6進行引物設(shè)計結(jié)果如下:結(jié)果發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫無法優(yōu)化出特異性強的引物，不僅在設(shè)計位點處與模板相同，與模板鏈內(nèi)部其他位置同源性大于70%，因此很有可能會擴增出錯誤或是不完整的模板片段。為了驗證這一結(jié)果，登錄Saccharomyces GENMOE DATABASE(SGD)進行在線引物設(shè)計，也無法設(shè)計出具有特異性的引物。這兩個基因序列引物設(shè)計的結(jié)果說明了密碼子優(yōu)化在PCR中的重要作用。引物特異性不夠強上游引物與模板內(nèi)部大量同源圖8.單克隆抗體VH

12、區(qū)3C6引物設(shè)計結(jié)果五利用IgBlast對單克隆抗體3C6序列進行胚系基因比對IgBlast可以用于免疫球蛋白序列分析，基于數(shù)據(jù)庫IMGT中不同物種的胚系基因進行比對。由于納米抗體來源為羊駝，胚系基因數(shù)據(jù)庫不含有該物種，因此繼續(xù)以專利中的單克隆抗體重鏈可變區(qū)3C6為研究對象。進入IgBlast界面，輸入序列，選擇物種為“鼠源”，結(jié)果如圖所示。D區(qū) J區(qū)V-D連接區(qū)D-J連接區(qū)（3）（2）（1） 圖9.將單克隆抗體VH區(qū)3C6與胚系基因進行比對抗體重鏈可變區(qū)是由V、D、J三種基因片段重排產(chǎn)生的，如圖中（1）所示，與抗體V基因片段相似度最高的的是鼠源胚系基因IGHV2-6-7*01，以及與D、J片

13、段相似最高的是IGHD2-5*01序列、IGHJ2*01序列。因此可以推測：IGHV2-6-7*01、IGHD2-5*01、IGHJ2*01三個胚系基因片段重排形成了鼠源的抗EGFR單克隆抗體可變區(qū)序列，在此基礎(chǔ)上進行人源化替換了一些基因位點，將鼠源抗體改造為人源抗體。圖中（2）顯示了抗體基因的比對結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)構(gòu)成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3的基因全部為V基因片段，這是由于V基因片段由2個編碼區(qū)組成：一個編碼區(qū)編碼大部分信號序列，另一個編碼區(qū)編碼信號序列包括互補決定區(qū)1和2。D基因片段編碼重鏈可變區(qū)大部分CDR3，J基因片段編碼CDR3除D基因片段編碼外的其余部分和FR4（C區(qū)

14、、D區(qū)在圖中標注）。圖中未顯示CDR3與FR4的具體區(qū)域。由圖中（3）可知抗體序列中存在V-D連接區(qū)、D-J連接區(qū)，（連接區(qū)在圖中標注）這兩段基因不是特異的，在其他的抗體重排過程中也可能會出現(xiàn)。胚系基因比對只提供了抗體基因片段可能的來源，由于連接區(qū)的存在，如果想要具體劃分CDR3和FR4需要進一步通過clustalX進行更大范圍的比對分析。六總結(jié)經(jīng)過生物信息學可知，納米抗體PMP9G8內(nèi)部具有8個折疊，同時含有一個二硫鍵，為了保證納米抗體的結(jié)合活性，組氨酸標簽應加在C端。納米抗體PMP9G8內(nèi)部有非常多的保守位點，框架區(qū)的保守位點參與納米抗體構(gòu)象組成，因此在基因突變時要著重考量這些氨基酸突變會

15、對納米抗體帶來的影響。在引物設(shè)計時。將經(jīng)過密碼子優(yōu)化和未優(yōu)化的序列進行對比，說明了序列密碼子優(yōu)化的重要性。同時通過對單克隆抗體重鏈可變區(qū)3C6的胚系基因比對，了解了該抗體基因的可能來源及重排情況。如果想要進一步了解納米抗體PMP9G8，還應該聯(lián)合使用更多的生物信息學軟件，對其理化性質(zhì)特點進行分析。附錄1：抗EGFR納米抗體PMP9G8氨基酸序列EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVVAINWSSGSTYYADSVKGRFTISR DNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGYQINSGNYNFKDYEYDYWGQGT

16、QVTVSS 附錄2：密碼子優(yōu)化后抗EGFR納米抗體PMP9G8基因序列CCATGGCCGAATTCGAAGTTCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGGCTGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCTGCTTCTGGTCGTACCTTCTCTTCTTACGCTATGGGTTGGTTCCGTCAGGCTCCGGGTAAAGAACGTGAATTTGTTGTTGCTATCAACTGGTCTTCTGGTTCTACCTACTACGCTGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCTCGTGACAACGCTAAAAACACCATGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAAACCGGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCGCTGCTGGTTACCAGATCAACTCTGGTAACTACAACTTCAAAGACTACGAATACGACTACTGGGGTCAGGGTACTCAGGTTAC附錄3：人源化EGFR單克隆抗體重鏈可變區(qū)3C6基因序列CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCCCCCTCCCAGTCCCTGTCCATCACCTGCACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAAC