微生物的育種

1、微生物的育種 在生物進(jìn)化過程中，微生物形成了愈來愈完善的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)能高度有序地進(jìn)行和對外界環(huán)境條件的改變迅速做出反應(yīng)。因此，處于平衡生長，進(jìn)行正常代謝的微生物不會有代謝產(chǎn)物的積累。而微生物育種的目的就是要人為地使某種代謝產(chǎn)物過量積累，把生物合成的代謝途徑朝人們所希望的方向加以引導(dǎo)，或者促使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生基因的重新組合優(yōu)化遺傳性狀，實現(xiàn)人為控制微生物，獲得我們所需要的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低耗的菌種。為了實現(xiàn)這一目的必須設(shè)法解除或突破微生物的代謝調(diào)節(jié)控制，進(jìn)行優(yōu)良性狀的組合，或者利用基因工程的方法人為改造或構(gòu)建我們所需要的菌株，本節(jié)主要討論解除或突破微生物的代謝調(diào)節(jié)和體內(nèi)基因重組

2、的途徑和策略，得到所需的優(yōu)良菌株。 第一節(jié)、突變與育種 一. 自發(fā)突變與育種 生產(chǎn)中選育菌株： 在日常生產(chǎn)過程中，微生物也會以一定頻率發(fā)生自發(fā)突變。具有實際經(jīng)驗和善于細(xì)致觀察的人就可及時抓住這類良機(jī)來選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。例如，從污染噬菌體的發(fā)酵液中有可能分離到抗噬菌體的新菌株。定向培育優(yōu)良菌株： 定向培育是指用某一特定因素長期處理某一微生物培養(yǎng)物，同時不斷對它們進(jìn)行傳代，以達(dá)到累積并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變體的一種古老的育種方法。由于自發(fā)突變的頻率較低，變異程度較輕微，所以培育新種的過程十分緩慢，一般要相當(dāng)長的時間。近年來，用梯度平板法篩選抗代謝拮抗物的變異菌株，以提高相應(yīng)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。例如，異煙肼

3、是吡哆醇的代謝拮抗物 ( 即結(jié)構(gòu)類似物 ) ，兩者分子結(jié)構(gòu)類似。定向培育抗異煙肼的吡哆醇高產(chǎn)菌株的方法：先在培養(yǎng)皿中加入 10ml 的一般瓊脂培養(yǎng)基，使皿底斜放，待凝固后，將皿底放平，再在原先的培養(yǎng)基上倒 10ml 含有適當(dāng)濃度 ( 據(jù)實驗而定 ) 的異煙肼的培養(yǎng)基，待凝。用此法制成的瓊脂平板上存在著一個由濃到稀的異煙肼的濃度梯度。然后在平板表面涂大量微生物細(xì)胞培養(yǎng)。低濃度異煙肼長滿了原始的敏感菌，而高濃度異煙肼區(qū)微生物的生長受到了抑制。只有在適中的部位才出現(xiàn)少數(shù)由抗異煙肼細(xì)胞形成的菌落。這類抗性菌落是由于供試菌中個別細(xì)胞產(chǎn)生了某種自發(fā)突變，所以能形成了抗異煙肼的突變體。根據(jù)微生物產(chǎn)生抗藥性的

4、原理，它們可能產(chǎn)生了分解異煙肼的酶類，也可能通過合成更高濃度的代謝產(chǎn)物 ( 吡哆醇 ) 來克服異煙肼的競爭性抑制作用。實驗結(jié)果證明，多數(shù)菌株因發(fā)生了后一類的突變才獲得抗性。因此，利用梯度平板法可達(dá)到定向培育某一代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的目的。二. 誘變育種 誘變育種是指利用物理或化學(xué)透變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變頻率大幅度提高，然后設(shè)法采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株，以供生產(chǎn)實踐或科學(xué)實驗之用。誘變育種具有極其重要的實踐意義。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過透變育種而大大提高了生產(chǎn)性能的。其中最突出的例子就是青霉素生產(chǎn)菌株的

5、選育。 1943 年，產(chǎn)黃青霉每毫升發(fā)酵液只產(chǎn)生約 20 單位的青霉素，通過透變育種和其它措施配合，目前的發(fā)酵單位已比原來提高了三四十倍，達(dá)到每毫升 5 萬 10 萬單位。誘變育種除能提高產(chǎn)量外，還可達(dá)到改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化生產(chǎn)工藝等目的，故仍是目前使用最廣泛的育種手段之一。 1 誘變育種的原則挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株：出發(fā)菌株就是用于育種的原始菌株。出發(fā)菌株適合，育種工作效率就高。參考以下實際經(jīng)驗選用出發(fā)菌株： 以單倍體純種為出發(fā)菌株，可排除異核體和異質(zhì)體的影響； 采用具有優(yōu)良性狀的菌株，如生長速度快、營養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株； 選擇對誘變劑敏感的菌株。由于有些菌株在發(fā)生某一變異后

6、，會提高對其它誘變因素的敏感性，故可考慮選擇已發(fā)生其它變異的菌株為出發(fā)菌株。例如，在金霉素生產(chǎn)菌株中，曾發(fā)現(xiàn)以分泌黃色色素的菌株為出發(fā)菌株時，產(chǎn)量下降，而以失去色素的變異菌株作出發(fā)菌株時，則產(chǎn)量會不斷提高。生產(chǎn)實踐證明，經(jīng)長期選用的菌株，繼續(xù)用誘變劑處理，有時很難使其產(chǎn)量再提高，特別是生產(chǎn)水平已很高的菌株。在此情況下，應(yīng)設(shè)法改變菌株的遺傳型，以提高菌株對誘變劑的敏感性； 許多高產(chǎn)突變往往要經(jīng)過逐步累積的過程，才變得明顯，所以有必要多挑選一些已經(jīng)過誘變的菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行多步育種，確保高產(chǎn)菌株的獲得。處理單孢子 ( 或單細(xì)胞 ) 懸液 ： 在誘變育種中，所處理的細(xì)胞必須是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液。

7、分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻地接觸誘變劑，又可避免長出不純菌落。由于在許多微生物的細(xì)胞內(nèi)同時含有幾個核，所以即使用單細(xì)胞懸浮液處理，還是容易出現(xiàn)不純的菌落。有時，雖然處理的是單核的細(xì)胞或孢子，但由于誘變劑一般只作用于 DNA 雙鏈中的某一條單鏈，故某一突變無法反映在當(dāng)代的表型上。經(jīng)過 DNA 的復(fù)制和細(xì)胞分裂，表型才會發(fā)生變異，出現(xiàn)不純菌落，這就叫表型延遲。不純菌落的存在，也是誘變育種工作中初分離的菌株經(jīng)傳代后很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀 “ 衰退 ” 的主要原因。 由于上述原因，故在誘變霉菌或放線菌時，應(yīng)處理它們的孢子；對芽孢桿菌則應(yīng)處理它們的芽孢 ( 因芽孢只有一個核質(zhì)體，而其營養(yǎng)體一般有兩個核質(zhì)體 ) 。

8、 細(xì)胞的生理狀態(tài)對誘變處理也會產(chǎn)生很大的影響。細(xì)菌在對數(shù)期誘變處理效果較好；霉菌或放線菌的分生孢子一般都處于休眠狀態(tài)，所以培養(yǎng)時間的長短對孢子影響不大，但稍加萌發(fā)后的孢子則可提高誘變效率。在實際工作中，要得到均勻分散的細(xì)胞懸液，通?？捎脽o菌的玻璃珠來打散成團(tuán)的細(xì)胞，然后再用脫脂棉過濾。選擇簡便有效、最適劑量的誘變劑 - 誘變劑主要有兩大類，即物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。物理誘變劑如紫外線、 X 射線、 射線和快中子等；化學(xué)誘變劑種類極多，主要有烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物。最常用的烷化劑有 N- 甲基 -N- 硝基 -N- 亞硝基胍 (NTG) 、甲基磺酸乙酯 (EMS) 、甲基亞硝基脲 (N

9、MU) 、硫酸二乙酯 (DES) 、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙烷等。要知道某一誘變劑是否有誘變作用以及誘變作用的強(qiáng)弱程度，最理想的方法當(dāng)然是設(shè)法直接測定它對提高某一菌種產(chǎn)量的實際效果究竟有多大?？墒窃诰唧w工作中，由于此法工作量太大，定量性狀不易確定，所以一般常用其他簡便而間接的方法來定性確定。例如營養(yǎng)缺陷型的回變法、抗藥性突變法、形態(tài)突變法或溶源細(xì)菌的裂解法等。采用這些方法的理論依據(jù)是：一切生物的遺傳物質(zhì)都是核酸，尤其是 DNA ，一切誘變劑的作用機(jī)制都是引起 DNA 分子結(jié)構(gòu)的改變。因此，凡對微生物有效的誘變劑，對高等生物同樣有效，反之亦然。同時，凡能引起某一性狀突變的誘變劑，對其他性狀也必然有

10、類似的作用。 1973 年建立的利用一組鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimulium) 營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變來檢測各種化學(xué)物質(zhì)對高等動物是否有致癌作用的艾姆氏試驗法 (Ames test) ，就是利用上述誘變劑 “ 共性原則 ” 的一個范例。利用這種大大簡化后的方法，發(fā)現(xiàn)化學(xué)藥劑對細(xì)菌的誘變率與其對動物的致癌性成正比關(guān)系 ( 約有 95% 的致癌劑都是誘變劑 ) 。目前常用的誘變劑主要有紫外線 (U 、V)、硫酸二乙酯、N- 甲基 -N- 硝基 -N- 亞硝基胍 (NTG 或 MNNG) 和亞硝基甲基脲 (NMU) 等。后兩種因有突出的誘變效果，所以被譽(yù)為“超誘變劑 ” 。各

11、種誘變劑有不同的劑量，用強(qiáng)度 × 時間表示，如紫外線的強(qiáng)度單位是爾格， X 射線的單位是倫琴 (R) 或拉得 (rad) 等，化學(xué)誘變劑的劑量則以在一定溫度下誘變劑的濃度和處理時間來表示。在育種實踐中，常采用殺菌率來作各種誘變劑的相對劑量。誘變劑的作用： 提高突變的頻率； 擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度； 使產(chǎn)量變異向正變 ( 即提高產(chǎn)量的變異 ) 或負(fù)變 ( 即降低產(chǎn)量的變異 ) 的方向移動。凡在高誘變率的基礎(chǔ)上既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。 要確定一個合適的劑量，通常要進(jìn)行多次試驗。根據(jù)對紫外線、 X 射線和乙烯亞胺等誘變效應(yīng)的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正變較多地出現(xiàn)

12、在偏低的劑量中，而負(fù)變則較多地出現(xiàn)于偏高的劑量中，還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，更容易出現(xiàn)負(fù)變。因此，在誘變育種工作中，目前比較傾向于采用較低的劑量。例如，過去在用紫外線作誘變劑時，常采用殺菌率為 99 %或 99.9% 的劑量，而近年來則傾向于采用殺菌率為 70% 75% ，甚至更低 (30% 70%) 的劑量，特別是對于經(jīng)多次誘變后的高產(chǎn)菌株更是如此。利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng) - 誘變劑的復(fù)合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)。復(fù)合處理有幾類：一類是兩種或多種誘變劑的先后使用；第二類是同一種誘變劑的重復(fù)使用；第三類是兩種或多種誘變劑的同時使用。 表：誘變因子的復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng) 菌種 單獨(dú)處理

13、 復(fù)合處理 誘變劑 突變率 (%) 誘變劑 突變率 (%) 土曲霉 紫外線 X 射線 21.3 19.7 X 射線 + 紫外線 42.8 土曲霉 氮芥 (0.1%) 紫外線 不明顯 4.7 氮芥 + 紫外線 11.0 鏈霉菌 紫外線 射線 31.0 35.0 紫外線 + 射線 43.6 金色鏈霉菌 (2U-84) 二乙烯三胺 硫酸二乙酯 紫外線 6.06 1.78 12.5 二乙稀三胺 + 紫外線 硫酸二乙酯 + 紫外線 26.6 35.86 灰色鏈霉菌 (JIC-1) 紫外線 9.8 紫外線 + 可見光照射 1 次 紫外線 + 可見光照射 6 次 9.7 16.6   2. 常用誘

14、變劑的使用方法 以紫外線和 5- 溴尿密啶分別代表物理和化學(xué)誘變劑進(jìn)行簡要介紹。(1) 紫外線這是一種使用方便、誘變效果很好的常用誘變劑。在誘變處理前，先開紫外燈預(yù)熱 20 分鐘，使光波穩(wěn)定。然后，將 3 5ml 細(xì)胞懸浮液置 6cm 培養(yǎng)皿中，置于誘變箱內(nèi)的電磁攪拌器上，照射 3 5 分鐘進(jìn)行表面殺菌。打開培養(yǎng)皿蓋，開啟電磁攪拌器，邊照射邊攪拌。處理一定時間后，在紅光燈下，吸取一定量菌液經(jīng)稀釋后，取 0.2ml 涂平板，或經(jīng)暗培養(yǎng)一段時間后再涂平板。(2)5- 溴尿嘧啶 (5-BU)稱取 5-BU ，加入無菌生理鹽水微熱溶解，使?jié)舛葹?2mg/ml 。將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期并重懸浮于緩沖液或生理

15、鹽水中過夜，使其盡量消耗自身營養(yǎng)物質(zhì)。將 5-BU 加入培養(yǎng)基內(nèi)，使其終濃度一般為 10 20g/ml ，混勻后倒平板，涂布菌液，使其在生長過程中誘變，然后挑單菌落進(jìn)行測定。處理孢子懸浮液時，可采用較高濃度的 5BU(100 1000g/ml) 與孢子懸浮液混合后振蕩培養(yǎng)，經(jīng)一定時間后適當(dāng)稀涂平板。其它化學(xué)誘變劑的處理方式大體相同，但在濃度、時間、緩沖液等方面隨不同的誘變劑有所不同，可參閱有關(guān)的實驗手冊和資料。為了提高誘變效率，常用物理、化學(xué)二種誘變劑交替使用，待誘變的菌株或孢子懸液一定要混勻，使其能均勻接觸誘變劑。此外菌株的生長狀態(tài)及對誘變劑的敏感性也是重要的參數(shù)。一般選用菌株的對數(shù)生長期效

16、果較好。3. 篩選策略雖然微生物可產(chǎn)生大量十分有價值的產(chǎn)物，但是它們完善的調(diào)節(jié)機(jī)制限制細(xì)胞只產(chǎn)生夠它們自身需要的少量產(chǎn)物，它們是十分“節(jié)約”的。微生物學(xué)家必須設(shè)法使它們變成“浪費(fèi)型”，才能從它們那兒得到我們所需要的代謝產(chǎn)物。長期實踐的結(jié)果表明，通過選育各種突變株是達(dá)到這一目的的重要策略。(1) 營養(yǎng)缺陷型突變株利用營養(yǎng)缺陷型突變株來生產(chǎn)氨基酸和核苷酸是典型的例子。由于在營養(yǎng)缺陷型中，生物合成途徑中某一步發(fā)生酶缺陷，合成反應(yīng)不能完成。通過外加限量的所要求的營養(yǎng)物，克服生長的障礙，而又使最終產(chǎn)物不致于積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，從而有利于中間產(chǎn)物或某種最終產(chǎn)物的積累。 在分枝代謝途徑中，利用營養(yǎng)缺陷

17、型突變株，通過解除協(xié)同反饋調(diào)節(jié)，可以有效地使另一分枝途徑中的終產(chǎn)物積累。棒狀桿菌 L- 賴氨酸生物合成途徑及其調(diào)節(jié)作用是一個分枝代謝途徑。從圖中可以看到天冬氨酸激酶 (AK) 被賴氨酸及蘇氨酸協(xié)同反饋所抑制。通過誘變處理，獲得了產(chǎn) L- 賴氨酸的不同營養(yǎng)缺陷型突變株，其中以高絲氨酸缺陷型突變產(chǎn) L- 賴氨酸的能力最強(qiáng)，該突變型不能產(chǎn)生蘇氨酸。在限量高絲氨酸的培養(yǎng)基中缺陷型菌株能夠正常生長，并且因為消除了反饋抑制，突變型能過量生產(chǎn) L- 賴氨酸。 (2) 抗阻遏和抗反饋突變型 抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調(diào)所造成的，它們都有共同的表型，即在細(xì)胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時仍然繼續(xù)不斷地合成這

18、一產(chǎn)物。如果這一終產(chǎn)物是我們所需要的某種氨基酸或核苷酸，那么這種突變型必然大大提高其產(chǎn)量。一般常用的方法是通過誘變處理后，選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，這些抗性突變株就包括了抗阻遏和抗反饋二種類型突變。所謂結(jié)構(gòu)類似物是指一些和細(xì)菌體內(nèi)氨基酸、嘌呤、維生素等代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)。當(dāng)把細(xì)菌培養(yǎng)在含有結(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)基上時，例如苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)類似物對氟苯丙氨酸，細(xì)菌的生長就受到抑制，即在不加苯丙氨酸的基本培養(yǎng)基上細(xì)菌不能生長，這是因為這些結(jié)構(gòu)類似物和代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，因此它也能和阻遏蛋白或變構(gòu)酶相結(jié)合，阻遏或抑制了苯丙氨酸的合成，而且由于這些結(jié)構(gòu)類似物往往不能代替氨基酸合成蛋白質(zhì)，它們在細(xì)胞內(nèi)的濃度

19、不會降低，因此它們和阻遏物或變構(gòu)酶的結(jié)合是不可逆的，這就使得有關(guān)的酶不可逆地停止了合成或是酶的催化活性不可逆的被抑制，因此細(xì)菌不能合成苯丙氨酸而受到抑制。所謂結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株，即是那些在含有類似物的環(huán)境中，其生長不被抑制的菌株這種抗性菌株是由于變構(gòu)酶結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變的結(jié)果，使結(jié)構(gòu)類似物不能與結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化的阻遏蛋白或變構(gòu)酶結(jié)合，細(xì)菌也照樣合成終產(chǎn)物，生長不受抑制。例如對氟苯丙氨酸是苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，因此對氟苯丙氨酸抗性菌株所產(chǎn)生的苯丙氨酸也不能與阻遏蛋白或變構(gòu)酶結(jié)合，這樣必然會在有苯丙氨酸存在的情況下，細(xì)胞仍然不斷地合成苯丙氨酸，使其得到過量積累，這就是抗阻遏或抗反饋突變株。（3）.抗性突變型篩選各種抗性突變型也是生產(chǎn)上常用來提高某些代謝產(chǎn)物的重要途徑?？股乜剐酝蛔冎辏涸诳股禺a(chǎn)生菌選育中，通過篩選抗生