胞核胞漿胞膜制備試劑盒

1、胞核胞漿胞膜制備試劑盒 Nucl-Cyto-Mem Preparation Kit貨號(hào)：P060089描述：從哺乳動(dòng)物新鮮或凍存的組織塊、貼壁或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，制備細(xì)胞核、細(xì)胞膜與胞內(nèi)質(zhì)膜、細(xì)胞漿等三種主要亞細(xì)胞組分。獨(dú)特的試劑成分與優(yōu)化的制備方案相結(jié)合，使胞核-胞膜-胞漿制備過程簡(jiǎn)單易行，無需特殊設(shè)備和超速離心，制備過程可在1小時(shí)內(nèi)完成。制備的細(xì)胞核、細(xì)胞漿組分純度甚高，而且較少交叉污染。單一的細(xì)胞膜的純化是一個(gè)特殊問題，本試劑盒制備的胞膜是細(xì)胞膜和細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及其質(zhì)膜的混合物。制備的細(xì)胞核是完整的未裂解的細(xì)胞核，但胞漿組分為可溶性胞漿蛋白。制備的亞細(xì)胞組分的純度可勝任后

2、續(xù)免疫共沉淀、SDS-PAGE、2-D gel電泳、Western Blotting、酶活性測(cè)定、受體分析等。組成：(100 extractions, 8 x 106 cells per extraction)CER, Cytosol Extraction Reagent，50 ml; MER, Membrane Extraction Reagent，5 mlNER, Nuclear Extraction Reagent，100 ml;Suspension Buffer，20 ml 儲(chǔ)存：4 ºC避光保存1年。收集細(xì)胞：準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，每一制備使用等量的細(xì)胞數(shù)，將明顯改善后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的一致

3、性。每一制備約需要8 x 106 1 x 107個(gè)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞：PBS沖洗細(xì)胞皿，胰蛋白酶消化細(xì)胞。800 x g 離心5-10 min。棄上清，用PBS重懸洗滌細(xì)胞并再次離心收集細(xì)胞。注意：為避免胰蛋白酶在后續(xù)制備過程中降解蛋白質(zhì)，可用無酶細(xì)胞消化液(Non-enzyme Cell Disassociation Solution)使貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞與瓶皿分離。懸浮細(xì)胞：800 x g 離心5-10 min。棄上清。用PBS重懸洗滌細(xì)胞并再次離心收集細(xì)胞。估計(jì)細(xì)胞沉淀壓積PCV (packed cell volume)：通常1 x 106 個(gè)細(xì)胞離心后的PCV約為10-20 ml，1 x 10

4、7 個(gè)細(xì)胞的PCV約為100 ml。注意PCV大小與細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，也與細(xì)胞類型、大小、離心速度有關(guān)。制備步驟 制備全程在4 ºC或冰水浴中進(jìn)行。1.1 細(xì)胞勻漿裂解每1 x 107個(gè)細(xì)胞或100 ml PCV的細(xì)胞沉淀加入500 ml CER試劑，震蕩重懸。冰浴2 min。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)。冰上上下手動(dòng)勻漿20-30次。注意：破碎細(xì)胞是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。用1-3 ml小容積玻璃勻漿器，須選用間隙嚴(yán)密的研杵，其特征是將研杵插入勻漿器套管后，可提起研杵而套管不會(huì)脫落。有效研磨是上下推拉研磨而不是旋轉(zhuǎn)。破碎效果與細(xì)胞類型有關(guān)?？稍谙嗖铒@微鏡下檢查，未裂解細(xì)胞應(yīng)少于5%。1.2

5、組織塊勻漿裂解取250 mg哺乳動(dòng)物新鮮或-80 ºC凍存的組織塊，勿剪碎為更小的塊。放入冰預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)。加入500 ml CER試劑。用研杵旋轉(zhuǎn)將組織塊搗碎，上下手動(dòng)預(yù)勻漿20次。冰浴10 min。然后上下手動(dòng)預(yù)勻漿7次。注意：與培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁細(xì)胞相比，組織塊中的細(xì)胞在勻漿時(shí)較易破碎，因而并非必須選用間隙嚴(yán)密的研杵。如果研杵與套管過于嚴(yán)密，組織勻漿困難，可選用研杵與套管稍松的勻漿器。破碎效果與組織細(xì)胞類型有關(guān)。可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細(xì)胞應(yīng)少于5%。2. 取出500 ml裂解混合物，轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管。800 × g，4 ºC離心5 min。

6、粗細(xì)胞核沉淀在管底，上清為胞膜-胞漿混合物。按照以下步驟首先制備膜與胞漿，然后制備細(xì)胞核，或用兩臺(tái)離心機(jī)同時(shí)制備。3. 膜與胞漿制備：3.1. 將步驟2 獲得的上清液轉(zhuǎn)移到新管，估計(jì)上清液體積；3.2. 立即加入1/10積量的MER與上清液混合。冰浴5分鐘；3.3. 最大轉(zhuǎn)速14,000 rpm 4 ºC離心30分鐘；3.4. 取出上清液轉(zhuǎn)移到新管，此為胞漿組分；3.5. 沉淀為胞膜組分，含細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜的混合物。再次瞬時(shí)離心除盡液體，用100 ml或適宜體積的Suspension Buffer或自備溶液重懸胞膜。4. 細(xì)胞核制備：4.1. 加入500 ml NER，振蕩重懸步驟

7、2 獲得的粗核。必要時(shí)按步驟勻漿胞核；4.2. 4000 × g，4 ºC離心5 min。棄上清；4.3. 再次加入500 ml NER洗滌胞核沉淀，并重復(fù)步驟，離心后的上清應(yīng)清亮；4.4. 棄上清除盡液體。用100 ml或適宜體積Suspension Buffer或自備溶液重懸細(xì)胞核。說明1. 制備的胞漿組分或重懸于Suspension Buffe的胞膜胞核組分可進(jìn)行Bradford法、Lowry法、BCA法蛋白定量、酶活性測(cè)定、受體分析。但進(jìn)行免疫共沉淀、SDS-PAGE、2-D gel電泳、Western Blot之前，需要1:1加入自備的2x 樣品緩沖液(含適宜濃度的去垢劑如NP-40、Triton X-100、SDS)。用戶可不用Kit中的Suspension Buffer，而直接用自行配制的樣品緩沖液重懸胞核或胞漿沉淀，但這是要考慮自配緩沖液中是否有影響蛋白定量的因素。2. 用SDS-PAGE Loading 緩沖液裂解細(xì)胞核后，DNA釋放會(huì)使核裂解物十分粘稠，可95 ºC加熱5 min，高速振蕩打斷DNA，重復(fù)加熱2-3次。3. 如果為凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)目的提取核蛋白，建議用#P1200: 核-胞漿蛋白制備試劑盒 (Nucl