質(zhì)粒DNA制備試劑盒

1、AxyPrep 質(zhì)粒 DNA 小量試劑盒本試劑盒采用改進的 SDS 堿裂解法,結(jié)合 DNA 制備膜選擇性地吸附 DNA 的方法達到快速純化質(zhì)粒DNA 的目的。適合于從 1-4 ml細菌培養(yǎng)物中提取多至 20 g 高純的質(zhì)粒 DNA ,用于測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實驗。一、 試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性Cat. No. AP-MN-P-4 AP-MN-P-50 AP-MN-P-250制備次數(shù) 4 preps 50 preps 250 preps制備管 4 50250 2 ml離心管 4 502501.5 ml離心管 4 50250 RNase A 10l 30l

2、150lBuffer S1 2 ml 15 ml 75 mlBuffer S2 2 ml 15 ml 75 mlBuffer S3 2.5 ml 21 ml 105 mlBuffer W1 2.8 ml 28 ml 135 mlBuffer W2 concentrate 2.4 ml 24 ml 2×72 mlEluent 1 ml 5 ml 25 ml說明書 1 1 1 RNase A:50 mg/ml,室溫可貯存 6個月,長期貯存于 -20°C 。Buffer S1:細菌懸浮液。加入 RNase A后,混合均勻, 4°C 貯存。Buffer S2:細菌裂解液(

3、含 SDS/NaOH ,室溫密閉貯存。Buffer S3:中和液,室溫密閉貯存。Buffer W1:洗滌液,室溫密閉貯存。Buffer W2 concentrate:去鹽液。使用前,按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇(可用 100%乙醇或95%乙醇 。混合均勻,室溫密閉貯存。Eluent :洗脫液,室溫密閉貯存。二、注意事項Buffer S2、 Buffer S3和 Buffer W1含刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套和眼鏡,避免沾染皮膚、眼睛和衣服,謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時,要立即用大量清水或生理鹽水沖洗,必要時尋求醫(yī)療咨詢。三、實驗準備1. 第一次使用前, RNase A全部加入 B

4、uffer S1中, 4°C 貯存。2. 準備無核酸和核酸酶污染的 Tip 頭、離心管。3. 第一次使用前, Buffer W2 concentrate中加入指定體積的無水乙醇。4. 使用前,檢查 Buffer S2是否出現(xiàn)沉淀,應(yīng)于 37°C 溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后再使用。四、操作步驟1. 取 1-4 ml在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液(若使用豐富培養(yǎng)基,菌液體積應(yīng)減半或更少 , 12,000×g 離心 1 min,棄盡上清。2. 加 250 l Buffer S1 懸浮細菌沉淀,懸浮需均勻,不應(yīng)留有小的菌塊。* 確認 Buffer S1中已加入 RNas

5、e A。3. 加 250 l Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn) 4-6次混合均勻使菌體充分裂解,直至形成透亮的溶 液。此步驟不宜超過 5 min。* Buffer S2使用后立即蓋緊瓶蓋,以免空氣中的 CO 2中和 Buffer S2中的 NaOH ,降低溶菌效率。* 避免劇烈搖晃,否則將導(dǎo)致基因組 DNA 的污染。* 此步驟不宜超過 5 min。4. 加 350 l Buffer S3,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合 6-8次, 12,000×g 離心 10 min。* 避免劇烈搖晃,否則將導(dǎo)致基因組 DNA 的污染。步驟 57可以選擇負壓法或離心法純化質(zhì)粒 DNA 。A. 負壓

6、法5A. 將質(zhì)粒 DNA 制備管插到負壓裝置的接口上。吸取步驟 4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管中, 開啟并調(diào)節(jié)負壓至 -25-30英寸汞柱,緩慢吸走管中溶液。6A. 加 500 l Buffer W1,吸盡管中溶液。7A. 加 700 l Buffer W2,吸盡管中溶液;以同樣的方法再用 700 l Buffer W2 洗滌一次。 * 確認在 Buffer W2 concentrate中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。* 兩次使用 Buffer W2沖洗能確保鹽份被完全清除,消除對酶切反應(yīng)的影響。8A. 將制備管置于 2 ml離心管(試劑盒內(nèi)提供中, 12,000×g 離心 1

7、min。B. 離心法5B. 吸取步驟 4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管(置于 2 ml離心管 (試劑盒內(nèi)提供 中, 12,000×g 離心 1 min,棄濾液。6B. 將制備管置回離心管,加 500 l Buffer W1, 12,000×g 離心 1 min,棄濾液。7B. 將制備管置回離心管,加 700 l Buffer W2, 12,000×g 離心 1 min,棄濾液;以同樣的方法再用 700 l Buffer W2洗滌一次。棄濾液。* 確認在 Buffer W2 concentrate中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。 * 兩次使用 Buffer W2

8、沖洗能確保鹽份被完全清除,消除對酶切反應(yīng)的影響。8B. 將制備管置回 2 ml離心管中, 12,000×g 離心 1 min。9. 將制備管移入新的 1.5 ml離心管(試劑盒內(nèi)提供中,在制備管膜中央加 60-80 l Eluent或去離 子水,室溫靜置 1 min。 12,000×g 離心 1 min。* 將 Eluent 或去離子水加熱至 65將提高洗脫效率。五、流程圖加 250 l Buffer S1加 250 l Buffer S2 加 350 l Buffer S3加 500 l Buffer W1 加 700 l Buffer W2 加 700 l Buffer

9、 W2加 60-80 l Eluent 或去離子水裂解 中和 結(jié)合 洗滌洗脫六、常見問題分析主要問題 原因 建議得率低或純化 不到質(zhì)粒 1. 質(zhì)粒丟失 在含有新鮮抗生素的平板上重新劃甘油菌培 養(yǎng)。若當前使用的是氨芐青霉素,可以考慮 試用羧芐青霉素。如果有必要,可重新轉(zhuǎn)化 質(zhì)?；蚴褂貌煌乃拗骶?。2. 細菌裂解不完全 1 菌量過多2 Buffer S2過期將菌量減少為原先的一半(實際操作中可按 實驗情況相應(yīng)調(diào)整 。Buffer S2中的 NaOH 被空氣中的 CO2中和。 使用完要立即擰緊瓶蓋。3. 細菌重懸不完全 在加入 Buffer S1后注意觀察細菌是否完全 懸浮、是否有菌塊殘留。4. 質(zhì)

10、粒過早的被洗脫確 保 buffer W2中 已 經(jīng) 加 入 正 確 體 積 的 95-100%無水乙醇。5. 洗脫效率低 1 膜過干 制備管在負壓裝置上抽干時間不宜過長。洗脫液或者去離子水 65°C 預(yù)熱以及增加洗 脫時間至 5min 都可提高洗脫效率。DNA 純度低 高純度的質(zhì)粒 A 260/280比值通常在 1.7-1.9之間。低于 1.7考慮蛋白質(zhì)污 染,高于 1.9考慮 RNA 污染。 1. A260/280比值過低表 現(xiàn) 為 瓊 脂糖 凝 膠 電 泳 的 背景 底 色 亮 和 酶 切效率低1 菌量過多2 加入 Buffer S1后菌體未 完全懸起3 加入 Buffer S2

11、后裂解不完全4加入 Buffer S3后中和不 完全2. A260/280比值過高表 現(xiàn) 為 電 泳時會出現(xiàn) RNA 條帶1 Buffer S1中未加入 RNase A2 Buffer S1保存不當, 或者已 經(jīng)過期, RNase A 活性下降3菌量過多4 加入 Buffer S1后菌體沒有 完全懸起5加入 Buffer S2后裂解不 完全主要問題 原因 建議瓊脂糖凝膠中 質(zhì)粒條帶模糊 通常質(zhì)粒條帶 模糊是由于降解影 響,而此降解可能 是宿主菌自身引起 的,也可能是純化 過程中造成 1. 使用 endA+宿主菌endA+是宿主菌中含有 endA 基因型,表達 Endonuclease I內(nèi)源核

12、酸酶部分 endA+宿主菌列表見下BMH71-18 NM522 (NM 系列宿主菌都是 End A +ES1301 PR700 (PR 系列宿主菌都是 End A +LE392 Y1088 ( Y10 系列宿主菌都是 End A +盡量使用 endA-宿主菌。 確保 Buffer W1 洗滌 1次。2. 菌培養(yǎng)時間過長 不要超過 16小時3. 存放 /處理收集菌時間過長 存放 3個月以內(nèi)4. 存放收集菌的方式不對 請于 -20以下存放5. 加入 Buffer S2后裂解不完全6. 加入 Buffer S3后中和不完全瓊脂糖凝膠電泳 出現(xiàn)多個條帶正常質(zhì)粒電泳會出現(xiàn)多條帶。清晰的主帶是質(zhì)粒的超螺旋

13、結(jié)構(gòu)。在超螺旋主帶的上方通常有 1-3條電泳更慢的條帶, 一般認為是開環(huán)質(zhì)粒和質(zhì)粒二聚體 (或者不同的交聯(lián)形式 。 偶爾也會有在超螺旋條帶前面出現(xiàn)微弱的稱為“不可逆變性質(zhì)?！睏l帶,這個是堿裂解的副產(chǎn)品。大多數(shù)酶對這種質(zhì)粒不起作用,包括限制性和測序的酶。 如果在 S2環(huán)境中時間過長, 會使得不可逆變性的質(zhì)粒含量增加。Buffer S2裂解不要超過 5min.10/09 Ver.1 主要問題 瓊脂糖凝膠電泳 背景底色亮 細菌碎片、基 因組和 RNA 污染都 顯現(xiàn)高亮電泳背景 3. 保存收集細菌的方法不對 4. 菌量過多 5. 加入Buffer S2后裂解不完全 6. 加入 Buffer S3 后中和不完全 基因組 DNA 污染 1. 培養(yǎng)時間過長， 大量細菌死亡和產(chǎn)生大量菌體碎 片 2. 菌量過多 3. 加入Buffer S2后震蕩劇烈/裂解不完全/作用時間 太長 4. 加入 Buffer S3 后劇烈震蕩/中和不完全 RNA 污染 少量的 RNA 污 染對于一般實驗來 說是沒有影響的。 DNA 酶切效果不好 酶切效果不好 可能是有抑制劑的 污染（比如鹽和乙 醇）或者質(zhì)粒修飾。 偶爾，質(zhì)粒在傳代 幾次后會產(chǎn)生缺 失。在排除其他原 因的情況下，要通 過測序才能確定。 5. 質(zhì)粒序列缺失 4. 核酸酶污染引起的質(zhì)粒降解 3. Buffer S2 作用時間過長 2. 乙醇污染 在