弓形蟲IgM酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒

1、弓形蟲IgM酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒（TOXO IgM ELISA TEST SYSTEM）體外診斷試劑 產(chǎn)品編號：8Z8651M簡 介：宙斯（Zeus）公司的弓形蟲 IgM 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒是應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)定性檢測人血清中的剛地弓形蟲IgM 抗體的系統(tǒng)。目的是為急性、有活性的或近期發(fā)生的剛地弓形蟲的感染提供血清學(xué)證據(jù)。本試劑盒必須結(jié)合抗弓形蟲IgG抗體的方法同時使用。本產(chǎn)品FDA沒有明確可以用于檢測血液和血漿供體。本方法還未能用于懷孕婦女和新生兒的檢測。背 景：剛地弓形蟲是一類分布在世界范圍內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)原生動物寄生蟲（1，2）。雖然貓科動物是其終宿主，但該生物體卻能感染幾乎所有的哺乳動物和鳥類

2、。血清學(xué)數(shù)據(jù)表明雖然不同國家的人弓形蟲盛行的種類不同，但大部分的工業(yè)化國家有大約30%的人都會慢慢受到該原蟲的感染，（3）。弓形蟲有三種存在形式：滋養(yǎng)體、包囊和卵囊（1，2）。滋養(yǎng)體（速殖子）在急性感染階段是具有攻擊性的形式。原蟲在宿主細(xì)胞胞質(zhì)中繁殖以后形成組織包囊形式，此時的包囊可以包含數(shù)千個生物體（緩殖子）。卵囊只在貓科動物的小腸上皮細(xì)胞中發(fā)育，并未在其他宿主中發(fā)現(xiàn)。卵囊隨著貓科動物排泄的糞便排出體外，數(shù)天后發(fā)育成熟。人類或其他動物攝取了具有包囊的生的、未加工的肉或具有卵囊的被貓的糞便污染了的食物便得到感染。一旦消化，該寄生蟲便從包囊中（緩殖子）被釋放出來，卵囊（孢子體）被消化酶消化并侵染

3、小腸粘膜。寄生蟲就地繁殖然后以包囊的形式轉(zhuǎn)移到其他器官，包囊可以在宿主的生命中長期存在。包囊主要存在于腦、心臟和骨骼肌中。感染剛地弓形蟲的人大多數(shù)（8090%）是無癥狀的（4）。感染急性弓形蟲的成年人大多表現(xiàn)的臨床癥狀為無癥狀的單結(jié)或多結(jié)淋巴結(jié)病癥狀，伴隨淋巴結(jié)病癥狀還有發(fā)熱、身體不適和非典型性淋巴細(xì)胞增多，癥狀與單核細(xì)胞增多癥相同。少數(shù)宿主患者通常會出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，像腦炎、心肌炎或局部急性肺炎等（1）。盡管感染剛地弓形蟲對于一般寄主通常并無疾病影響，但是，對于那些患有免疫缺陷疾病的寄主卻是致命的（5）。免疫缺陷的病人可以發(fā)展成具有嚴(yán)重傳染性的弓形蟲病，或弓形蟲性腦炎，或者同時患上這兩種病。

4、弓形蟲在艾滋病患者體內(nèi)通常會侵染患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（6）。血清學(xué)證據(jù)表明，弓形蟲性腦炎是艾滋病患者身上的潛在傳染病，大約30%的弓形蟲抗體陽性的艾滋病患者將會發(fā)展成弓形蟲性腦炎（7）。當(dāng)一名血清學(xué)檢測陰性的婦女在懷孕期間感染了弓形蟲，該生物體便通過胎盤傳送給胎兒（1，8）。胎兒感染的嚴(yán)重性根據(jù)感染的時期不同而有所不同，前期感染的可以導(dǎo)致孕婦自然性流產(chǎn)，或者順利生產(chǎn)但新生兒有明顯的疾病癥狀。如果在懷孕后期感染，新生兒通常會沒有癥狀，所以不易識別（8）。先天性感染弓形蟲病的新生嬰兒大約有75%是無癥狀的。然而，幾乎所有具有潛在弓形蟲病的兒童在他以后的成長過程中其視力或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育均會留下后遺癥。大

5、約8085%的兒童發(fā)育成視網(wǎng)膜炎，甚至一些兒童會失明或者患上精神性運動或智力障礙。目前，有很多種檢測剛地弓形蟲抗體的血清學(xué)方法作為輔助診斷急性傳染或評價先前感染弓形蟲的方法。常用的方法包括：Sabin-Feldman 染色法、直接凝集法、間接凝集法、乳膠凝集法、間接免疫熒光法和ELISA法（9）。感染剛地弓形蟲的患者大多數(shù)在第一周即可出現(xiàn)IgM抗體，并且僅存在短暫的時期（1）。檢測IgM抗體的血清學(xué)方法能夠幫助鑒別近期獲得傳染的病人（1，2，4）。檢測剛地弓形蟲IgM抗體的血清學(xué)方法包括間接熒光法、免疫凝集法和ELISA法（4，9，10，11）。ELISA法最早是由Engvall和Perlma

6、n 提出的（12，13），以后，ELISA檢測系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于各種各樣的抗原和抗體檢測（14）。應(yīng)用ELISA法檢測剛地弓形蟲是非常特異的、靈敏的和可靠的（9，11）。ELISA法在每一個測試樣本中都加入了確定的目標(biāo)抗體，適用于檢測大量的病人樣本。IgG抗體是弓形蟲IgM的高度類似物，如果它存在于標(biāo)本中，會干擾IgM抗體的特異性檢測。高度類似物IgG抗體可以先于IgM抗體與剛地弓形蟲抗原結(jié)合，造成IgM抗體假陰性結(jié)果（14）；同樣，類風(fēng)濕性因子（RF）如果與IgG特異性抗原同時存在，它可以與IgG特異結(jié)合而造成IgM抗體假陽性的結(jié)果（15）。以上兩個問題可以通過在測試前去除標(biāo)本中的IgG來得到

7、解決。目前，已經(jīng)有幾種方法被應(yīng)用于分離IgG。這些方法包括，過濾法、蛋白A吸收法、離子交換層析法和抗人IgG血清共沉淀法。ELISA法檢測原理：宙斯公司的TOXO IgM ELISA 檢測系統(tǒng)是針對由于感染TOXO抗原而產(chǎn)生IgM類抗體，并對此抗體進行檢測而設(shè)計的測試系統(tǒng)。整個檢測步驟包括三步溫育過程。1 用提供的樣品稀釋液稀釋待測血清。樣品稀釋液中含有抗人IgG，它可以將樣品中的IgG和類風(fēng)濕因子沉淀掉，使IgM得以和弓形蟲抗原反應(yīng)。在樣品溫育過程中，特異性的IgM抗體將與免疫抗原結(jié)合。然后洗去未結(jié)合的抗體和血清中其他的成分。2 結(jié)合有過氧化物酶的羊抗人IgG（m鏈），加到微孔板上溫育。結(jié)合

8、物與第一步中事先連接在板上的抗體雜交。然后洗去未反應(yīng)的結(jié)合物。3 固定在微孔板上的免疫過氧化物酶結(jié)合物與其底物溶液反應(yīng)，底物水解發(fā)生顏色變化。一定時間后終止反應(yīng)，讀取光吸收值即可。溶液顏色的深淺與原始待測樣本中的抗體濃度有關(guān)。2.試劑盒提供成份每個試劑盒內(nèi)包含有足夠數(shù)量的下列組份，以便于能進行包裝所示的試驗次數(shù)。1 酶標(biāo)板。96孔12條8孔板，用滅活弓形蟲（ RH鏈）抗原包被的酶標(biāo)板，酶標(biāo)板放置在酶標(biāo)板框架上并密封在一個含有干燥劑的包裝袋中。2 結(jié)合劑。辣根過氧化物酶結(jié)合的抗人IgM（鏈）。直接使用，15ml，一瓶，白色蓋子。內(nèi)加防腐劑。3 ml一支，紅色蓋子。內(nèi)加防腐劑。4 ml一

9、支，藍(lán)色蓋子。內(nèi)加防腐劑。5 ml一支，綠色蓋子。內(nèi)加防腐劑。6 樣品稀釋液。30ml，一瓶（藍(lán)色蓋子）。溶液中含有Tween-20、BSA、磷酸鹽緩沖液（±0.2）和抗人IgG(鏈)，。紫色溶液，直接使用。注：使用前充分混勻。（產(chǎn)品編號：005M）。內(nèi)加防腐劑。7 TMB。15ml一瓶，琥珀色瓶子（琥珀色蓋子），含有TMB，直接使用。溶液中含DMSO15%（W）。8 終止液。15ml一瓶，紅色蓋子，溶液中含有1 M H2SO4，0.7M HCl。直接使用。9 濃縮洗板液（10濃度）：1份濃縮洗板液加9份的去離子水或蒸餾水。100ml一瓶(透明蓋子)，含有10濃度磷酸鹽緩沖液（

10、77;0.2）、Tween-20（藍(lán)色溶液）。內(nèi)加防腐劑。（注：1濃度的溶液PH應(yīng)為±。）以下溶液不是每批都有差別的，可以通用于ELISA試劑盒：TMB、終止液、洗板液。注：試劑盒內(nèi)同樣包括有：1 各組分清單和不同批號特異的資料。2 使用說明書預(yù)先警告：1 用于體外診斷。2 接觸實驗室試劑時常規(guī)的注意事項。如果接觸到眼睛，立即用大量的水沖洗并到醫(yī)院檢查。穿適當(dāng)?shù)姆雷o服，戴手套和眼/臉保護設(shè)備。不要呼吸到蒸汽。處理廢棄物時遵守相關(guān)法規(guī)。3 ELISA板上沒有活性的有機物。但應(yīng)將之視為有潛在生物毒性的物質(zhì)并小心處理。4人血清對照品是有潛在生物毒性的物質(zhì)。產(chǎn)品的原材料經(jīng)檢測對HIV-1抗原

11、和HBsAg以及抗HCV、抗HIV抗體是陰性的。但沒有實驗方法可以完全確保無感染因素，因此，這些樣品還是應(yīng)該按照生物安全標(biāo)準(zhǔn)2進行處理。根據(jù)疾病控制中心和國家健康控制研究院手冊“微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室的生物安全”現(xiàn)版本和對血液病原體處理的OSHAs標(biāo)準(zhǔn)推薦的方法，處理任何具有潛在傳染性的人血清或血液制品。5 嚴(yán)格按照說明書中指定的溫育時間和溫度操作是獲得正確結(jié)果的重要保證。實驗前一定要使所有試劑的溫度回復(fù)至室溫（2025）。沒有用完的試劑應(yīng)立即放回到冰箱。6 不正確的清洗會導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果。加入結(jié)合試劑和底物溶液之前一定要確保盡量拍干的殘留的洗板液。另外，在溫育過程中要避免微孔干透。7

12、 人血清對照、樣本稀釋液、結(jié)合物和濃縮洗板液都包含有防腐劑（thimerosal,0.04%(w/v)），一旦誤服將引起中毒。8 終止液有毒，如果吸入、接觸到皮膚或誤服將燒壞。如果發(fā)生此類情況立即就醫(yī)。9 TMB溶液將刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚。10. 濃縮的洗板液將刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚。11. 擦掉微孔板底部殘留的試劑和手印以免影響OD讀數(shù)。12. 稀釋或摻雜其他試劑會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。13. 不要用其他批號的試劑或其他廠家的產(chǎn)品來替代試劑盒中的試劑。14. TMB溶液應(yīng)該是無色的。當(dāng)使用時，顯示很淺的黃色、綠色或蘭色。它與結(jié)合物或其他氧化物的污染會導(dǎo)致溶液過早地改變顏色。如果底物溶液已經(jīng)變

13、成明顯的藍(lán)色時切勿使用。15. 切勿用嘴吸移液管。避免試劑和病人樣品與皮膚或粘膜接觸。16. 避免試劑被微生物污染，這將產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。17. 試劑和樣本的交叉污染會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。18. 重復(fù)使用的玻璃容器應(yīng)清洗，并徹底沖去洗滌劑。19. 避免溶液飛濺或產(chǎn)生氣溶膠。20. 在儲存和溫育過程中，避免把試劑暴露在強光下。21. 先將微孔板回復(fù)至室溫，然后再打開袋子，這樣可以避免孔中成分的凝結(jié)。22. 洗板液應(yīng)該收集在處理盤中，用10%的家用漂白劑（0.5%次氯酸鈉）進行消毒。23. 注意：酸性pH的廢液在加漂白劑處理前必須先中和。24. 如果干燥劑上的指示條已經(jīng)從蘭色變成粉紅色，不要再使用ELI

14、SA板了。25. 不要讓結(jié)合劑接觸到含有疊氮鈉的溶液，微量的疊氮鈉就會影響結(jié)合劑的酶活力。26. 不要讓任何反應(yīng)試劑接觸到含有漂白劑的溶液。微量的漂白劑（次氯酸鈉）會影響試劑盒內(nèi)很多試劑的生物活性。自備設(shè)備和材料：1 能在450nm讀數(shù)的酶標(biāo)儀2 能精確吸取10到200ul的移液器3 多通道移液器，能精確吸取50-200 ul4 適用于多通道移液器的貯液槽5 洗瓶或洗板機6 蒸餾水或去離子水7 1L量筒8 專用于吸血清的移液器9 一次性吸頭10. 紙巾11. 實驗室用的計時器以便控制溫育時間12. 裝有消毒劑的廢液缸（例：10%的家用漂白劑、0.5%的次氯酸鈉）保存條件：1 未開封的試劑盒：保

15、存在2-8°C。2 微孔板條：保存在2-8°C。已開封未用完的微孔板應(yīng)立即放入原有密封袋中，保存在2-8°C。只要干燥劑上的指示條仍為蘭色，密封袋開封后，板條可穩(wěn)定60天。3 結(jié)合劑：保存在2-8°C。不得凍存。4 校正品、陽性和陰性對照：保存在2-8°C。5 TMB：保存在2-8°C。6 濃縮的洗板液（10´）：保存在2-25°C。稀釋到1´濃度后在室溫（20-25°C）可穩(wěn)定7天，或在2-8°C可穩(wěn)定30天。7 樣本稀釋液：保存在2-8°C。8 終止液：保存在2-25&#

16、176;C。標(biāo)本采集：1. 建議根據(jù)NCCLS的M29號文件來采集標(biāo)本（接觸有傳染性疾病的實驗 室工作者的防護）。2. 沒有已知的試驗方法可以完全證明人的血液標(biāo)本不會導(dǎo)致感染，因此，所有的血液都應(yīng)視為有潛在的傳染性。3 本試驗選用的標(biāo)本為無菌靜脈穿刺取得的血液，經(jīng)新鮮沉降和冷藏獲得的血清。不得使用抗凝劑和防腐劑。避免使用溶血、脂血和細(xì)菌污染的血清。4 標(biāo)本在室溫保存不得超過8小時。如果8小時內(nèi)不進行檢測，應(yīng)把血清保存在2-8°C最多48小時。如時間更久，應(yīng)把標(biāo)本放在-20°C或更低。不要反復(fù)凍融標(biāo)本以免造成抗體活力降低并影響最終結(jié)果。操作步驟：1 將試劑盒組分從貯存條件取出

17、，使其恢復(fù)至室溫（20-25）。2 確定試驗所需微孔板數(shù)量。每次試驗都應(yīng)設(shè)六個質(zhì)控品/校正品（一個試劑空白對照、一個陰性對照、三個校正品和一個陽性對照）。每次試驗均需設(shè)置試劑空白對照。檢查軟件和酶標(biāo)儀以確認(rèn)質(zhì)控品/校正品的參數(shù)。將剩余的板條仍然放入有干燥劑的密封袋中，保存在2-8。樣本排列12A空白對照標(biāo)本3B陰性對照標(biāo)本4C校正品等等D校正品E校正品F陽性對照G標(biāo)本1H標(biāo)本23 按1：21倍數(shù)稀釋陽性對照、校正品、陰性對照和每個病人的血清樣品（例如：10ml血清+200ml樣本稀釋液，使用前充分混勻）。4 在每個孔內(nèi)加入100ml稀釋過的對照、校正品和樣本。保證標(biāo)本充分混勻。不同的樣本使用不

18、同的吸頭。5 加入100ml樣本稀釋液于A1作為試劑空白對照。檢查軟件和酶標(biāo)儀以確認(rèn)試劑空白的參數(shù)。6 板條在室溫（20-25°C）溫育25±5分鐘。7 洗板5次。A 手工洗板步驟：a 甩掉孔中的液體。b 在每個孔內(nèi)加入洗板液，確?？字袩o氣泡。c 重復(fù)a和b步驟，洗板5次。d 甩掉孔中的洗板液，在紙巾上拍干孔中的洗板液。目測微孔中無殘留洗板液。把洗板液收集在廢液缸中，并在每天實驗結(jié)束用%次氯酸鈉處理。B 自動洗板步驟：如果使用自動洗板機，把洗板溶液體積設(shè)置為300-350ml/孔。設(shè)置無間隔循環(huán)清洗五次。最后將微孔板從洗板機上取下，置于紙巾上拍干。8 每孔中加入100ml結(jié)

19、合劑，按照樣品加入的順序以相同的速率和順序依次加入微孔板中。9 微孔板在室溫（20-25°C）溫育25±5分鐘。10. 按照步驟7進行洗板。11. 每孔中加入100mlTMB，按照樣品加入的順序以相同的速率和順序依次加入微孔板中。12. 微孔板在室溫（20-25°C）溫育10-15分鐘。13. 每孔加入50ml終止液以終止反應(yīng)，按照TMB底物溶液加入的順序以相同的速率和順序依次加入微孔板中。陽性的標(biāo)本會從蘭色變?yōu)辄S色。加入終止液后，拍打平板數(shù)次以確保樣品完全混合。14. 將微孔板置于450nm波長下讀取每個孔的光密度值，以空白試劑作對照。應(yīng)在加入終止液30分鐘內(nèi)讀

20、取數(shù)據(jù)。質(zhì)量控制：1 每次試驗中，校正品都要重復(fù)3次。同時包括一個試劑空白對照、陰性對照、陽性對照。2 計算3個校正品的平均值。如果有一個值超過平均值的15%，則剔除后計算另兩個孔的平均值。3 校正品的平均OD值和陽性對照、陰性對照的值應(yīng)在以下范圍：OD值范圍陰性對照£校正品³陽性對照³A. 陰性對照的OD值除以校正品的平均OD值應(yīng)£B. 陽性對照的OD值除以校正品的平均OD值應(yīng)³C. 如果不符合上述要求，認(rèn)為本次試驗無效應(yīng)重復(fù)試驗。4 陽性對照和陰性對照用來監(jiān)控試劑的情況，并不能保證Cutoff值的準(zhǔn)確性。5 根據(jù)要求還可以加入其他對照。6

21、本質(zhì)量控制參照NCCLS的C24號文件：定性測試的統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制。結(jié)果判斷：A 計算：1 校正因子陽性對照的cutoff值由生產(chǎn)者確定，并與校正品有關(guān)。校正因子（CF）可以幫助你判斷陽性標(biāo)本的域值，糾正每次實驗中細(xì)微的讀數(shù)變化。校正因子的確定應(yīng)決定于不同批的試劑盒的不同組分，并打印在試劑盒的組分表中。2 Cutoff值用校正因子乘以校正品的平均值即獲得Cutoff值。3參考值或OD比率每個標(biāo)本都要計算參考值或OD比率，方法是它們的OD值除以步驟2中得來的cutoff值。例如：校正品的平均OD值校正因子（CF）Cutoff值´未知標(biāo)本的OD值標(biāo)本的參考值或OD比率B 說明：參考值或OD

22、比率按如下判斷：參考值或OD比率陰性樣本可疑樣本陽性樣本1 OD比率IgM抗體。陰性結(jié)果表明近期或以前未感染過弓形蟲。這樣的個體懷疑為早期感染者，早期感染階段如果標(biāo)本采集時間過早，則可能檢測不到IgM抗體。如果懷疑該患者為早期感染者，應(yīng)該在7天內(nèi)再次采集該個體的標(biāo)本，并將新采集的標(biāo)本與前面的標(biāo)本同時重復(fù)試驗。2OD比率IgM抗體陽性。該結(jié)果表明該個體為感染或近期感染弓形蟲。檢測到高于Cutoff值的結(jié)果的數(shù)值，并不表明抗體存在的數(shù)量。3 樣本的OD比率如果在以下范圍內(nèi)（0.91-1.09），應(yīng)該重復(fù)試驗。如果重復(fù)實驗的結(jié)果相同，該個體的標(biāo)本應(yīng)該在7天內(nèi)重新采集并與前面的標(biāo)本重復(fù)實驗。如果第二次

23、的結(jié)果仍在上述范圍內(nèi)（或陰性），兩個標(biāo)本均應(yīng)做弓形蟲IgG抗體檢測試驗。如果第一個標(biāo)本，或兩個標(biāo)本結(jié)果為IgG抗體陽性，很可能是早期感染過病源蟲，在IgG存在的情況下，殘留IgM被檢測。如果兩個標(biāo)本檢測IgG時均為陰性，很可能是早期感染患者。按照臨床要求，應(yīng)該采集另一標(biāo)本并同時與第一標(biāo)本同時試驗，或者二者選一?？构蜗xIgM抗體抗弓形蟲IgG抗體報告/注釋陰性陰性患者可能還沒有感染弓形蟲或不是急性感染期。如果癥狀持續(xù)，則在三周內(nèi)提交一份新的標(biāo)本進行檢測。陰性陽性該結(jié)果不能判斷患者是否感染了弓形蟲?；颊吆芸赡苡性摬∈?，可能在一年前感染過弓形蟲。陰性可疑采集新的標(biāo)本進一步試驗?；颊呖赡軟]有急性感染

24、弓形蟲，也不能確定患者以前是否感染過弓形蟲?？梢申幮圆杉碌臉?biāo)本重新檢測弓形蟲IgM抗體。這個結(jié)果不能確定患者是否急性感染了弓形蟲。顯示患者以前未感染過弓形蟲。如果新采集的標(biāo)本檢測 IgM抗體的結(jié)果是陽性或仍為可疑，樣本應(yīng)送至弓形蟲檢測經(jīng)驗豐富的標(biāo)準(zhǔn)實驗室做進一步的試驗?？梢申栃圆杉碌臉?biāo)本重新檢測弓形蟲IgM抗體。不能確定患者是否急性感染或已感染弓形蟲?；颊呖赡芤郧案腥具^弓形蟲。如果新采集的標(biāo)本IgM抗體檢測結(jié)果仍為可疑或陽性，樣本應(yīng)送至弓形蟲檢測經(jīng)驗豐富的標(biāo)準(zhǔn)實驗室做進一步的試驗?？梢煽梢刹杉碌臉?biāo)本做進一步試驗。不能確定患者是急性感染還是已經(jīng)感染了弓形蟲。如果新采集的標(biāo)本IgM抗體檢測結(jié)

25、果為可疑或陽性，樣本應(yīng)送至弓形蟲檢測經(jīng)驗豐富的標(biāo)準(zhǔn)實驗室做進一步試驗。陽性陰性采集新的標(biāo)本進一步試驗。患者可能急性感染，也可能沒有急性感染弓形蟲，因為弓形蟲IgG抗體檢測是陰性的，可能標(biāo)本采集時間過早。采集新的標(biāo)本用不同的弓形蟲IgM檢測方法重新檢測，如果新標(biāo)本的檢測結(jié)果仍為陽性，標(biāo)本應(yīng)送至弓形蟲檢測經(jīng)驗豐富的標(biāo)準(zhǔn)實驗室做進一步的試驗。陽性陽性患者可能感染，也可能沒有急性感染弓形蟲。采集新的標(biāo)本做進一步試驗。因弓形蟲IgG抗體檢測陽性，很可能患者急性感染了弓形蟲。新采集的標(biāo)本應(yīng)該再重復(fù)一次。如果新采集的標(biāo)本IgM和IgG抗體結(jié)果檢測仍為陽性，標(biāo)本應(yīng)送至弓形蟲檢測經(jīng)驗豐富的標(biāo)準(zhǔn)實驗室做進一步的試

26、驗。陽性可疑不能確定患者是否急性感染了弓形蟲。采集新的標(biāo)本做進一步的試驗?；颊咭郧笆欠窀腥具^弓形蟲不能確定?？赡軜?biāo)本采集時間過早。新采集的標(biāo)本用不同的弓形蟲IgM檢測方法重新檢測。如果新標(biāo)本弓形蟲抗體的檢測IgM仍為陽性，而IgG結(jié)果為陽性/陰性/不確定，標(biāo)本應(yīng)送至弓形蟲診斷檢測經(jīng)驗豐富的標(biāo)準(zhǔn)實驗室做進一步的試驗。方法的限制性：1 宙斯公司弓形蟲IgM ELISA 診斷試劑盒的實驗結(jié)果不能作為唯一的診斷依據(jù)，試驗結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床評價和其他診斷方法結(jié)果進行綜合判斷。2 一些病人早期感染了弓形蟲，其IgM抗體的低水平會保持一年左右（1）。弓形蟲IgG特異抗體的檢測在評價這些病人的血清學(xué)診斷中有一定的

27、價值。3 弓形蟲感染的初級階段，標(biāo)本采集如果時間過早，可能會導(dǎo)致檢測不到IgM抗體（4）。有一些病人，感染病源蟲三周IgM特異抗體檢測，結(jié)果可能會轉(zhuǎn)為陰性（1）。那么檢測這些病人的弓形蟲IgG特異抗體，在血清學(xué)診斷中有一定的價值。4 弓形蟲IgM 特異抗體在患有免疫缺陷或先天性弓形蟲病的病人體內(nèi)可能檢測不到（2）。5 在自然發(fā)生的能夠檢測到弓形蟲IgM抗體病例里，可能會伴隨IgG抗體陽性，也可能不會，這已有相關(guān)報導(dǎo)（21，22）。這時不能確認(rèn)是刺激物還是自然生產(chǎn)的抗弓形蟲的IgM抗體。6 感染了EB病毒的病人體內(nèi)會存在異型的IgM抗體，用本試劑盒檢測時可能會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。7 弓形蟲IgG抗

28、體可以與IgM競爭同抗體結(jié)合位點結(jié)合，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。類風(fēng)濕因子（IgM）如果與弓形蟲IgG同時存在，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。吸收溫育步驟功能上將會去除標(biāo)本中99% 以上的IgG，因此會明顯降低假陽性或假陰性結(jié)果的可能性。8 患有自身免疫疾病的患者會發(fā)生弓形蟲抗體假陽性的結(jié)果（23）。9 宙斯公司弓形蟲IgM ELISA檢測還不能應(yīng)用到新生兒標(biāo)本的檢測上。10.弓形蟲IgM檢測陰性結(jié)果，不能排除免疫缺陷病人急性感染的可能性?；加忻庖呷毕莶∪说臉?biāo)本，弓形蟲IgG抗體檢測一般較低，而IgM抗體檢測不到（24）。IgM抗體數(shù)量明顯很少，因此以下特征值可能在不同的實驗室并沒有代表性。IgM抗體之類的物質(zhì)

29、數(shù)量非常少，因此實驗的陽性結(jié)果屬于假陽性的可能性越來越大，而降低了陽性的預(yù)期值。期望值：弓形蟲IgM抗體的量在癥狀將要發(fā)生和剛剛發(fā)生時會急劇升高，并在一個月內(nèi)達(dá)到一個頂峰濃度（1，4）。大多數(shù)病人在4-6個月內(nèi)，抗體的量就會降到較低水平（4）。有一些病人在感染8個月到1年內(nèi)均可檢測到IgM特異性抗體（1，11）。作為比較研究的部分資料，檢測了131例無癥狀的普通標(biāo)本，統(tǒng)計結(jié)果列于表3和表4。研究進展：比較研究：宙斯公司生產(chǎn)的弓形蟲IgM ELISA檢測系統(tǒng)與市售其他公司的用ELISA方法檢測弓形蟲IgM抗體的產(chǎn)品進行了兩個比較研究。第一個研究：試驗血清標(biāo)本共為157個，26個陽性標(biāo)本來自于弓形

30、蟲病標(biāo)準(zhǔn)實驗室，131個陰性標(biāo)本為美國東南部獻血者血清標(biāo)本。標(biāo)準(zhǔn)實驗室弓形蟲標(biāo)本中IgM抗體的存在判斷主要基于該實驗室Sabin-Feldman染色陽性的結(jié)果。弓形蟲IgM捕獲ELISA方法和臨床診斷方法不一致的標(biāo)本，用市售產(chǎn)品弓形蟲IgM IFA檢測系統(tǒng)檢測，以上研究的實驗結(jié)果見表1、2、3、4：表一宙斯公司弓形蟲IgM ELISA相對靈敏度92.2%（26/28）相對特異性100%（122/122）相對符合率98.7%（148/150）*用一種或兩種ELISA方法檢測出的7個可疑陽性標(biāo)本不列入上述計算。表二 弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)實驗室提供的標(biāo)本（n=26）Zeus 弓形蟲 IgM ELISA+-&#

31、177;總計市售弓形蟲IgM ELISA(捕獲)+251026-0000±0000 總計26相對靈敏度=96.2（25/26）注：請注意“相關(guān)性”指的是本方法的實驗結(jié)果與同類方法相比較。而不是方法與疾病的相關(guān)性。表三 常規(guī)獻血者標(biāo)本（n=131）宙斯公司弓形蟲 IgM ELISA試劑盒+-±總計市售弓形蟲IgM ELISA(捕獲)+1（a）10(b#177;07(c)07 總計131(a)-IFA檢測陽性(b)-不一致結(jié)果-參看表四(c)-可疑結(jié)果，排除計算。表四、分析不一致獻血者結(jié)果樣品編號宙斯弓形蟲IgM ELISA市售弓形蟲IgM ELIS

32、A市售IFA 2249（p）*65（p）87（p）123（p）124（p）128（p）129（p）130（p）132（p）* 參照染色反應(yīng)對弓形蟲抗體是非特異的。我們用宙斯公司弓形蟲IgM檢測系統(tǒng)對這些無癥狀的、正常人群分析的結(jié)果為，相對特異性100%（113/113）?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，宙斯公司弓形蟲IgM檢測試劑盒相對靈敏度、相對特異性和符合率總結(jié)見表一。第二個研究為選用可能含有弓形蟲特異IgM抗體的未知樣品（n=19）進行檢測。研究結(jié)果總結(jié)見表五。表五 未知樣品評價Zeus 弓形蟲 IgM ELISA+-±總計市售弓形蟲IgM ELISA(捕獲)+152*017-0202

33、77;0000 總 計19*IFA 陽性相對靈敏度=82.2%（15/17）相對特異性=100.0%（2/2）置信度百分比=89.5%（17/19）重復(fù)性：為了評估檢驗過程的intra-assay和inter-assay，我們對6個樣本的強陽性、弱陽性、陰性的OD比范圍進行檢測。將每個樣本復(fù)制8份，在3個連續(xù)工作日中對其進行檢測。計算每個樣本的平均OD比和CV值。數(shù)據(jù)顯示如下：Intra-Assay（N=8）Inter-assay（N=3）血清樣本 一次檢測 二次檢測 三次檢測平均比 CV平均比CV平均比CV平均比CV1HP3.5%6.2%3.2%4.3%2HP8.3%3MP8.7%2.5%9

34、.6%6.9%4LP14.6%13.6%15.3%14.5%5N9.6%11.1%16.9%12.5%6N12.8%27.2%2.6%2.2%交叉實驗：該試驗是為了評價類風(fēng)濕因子（RF）、EBV-IgM和抗核抗體（ANA）的干擾。含有EBV-IgM抗體的9個標(biāo)本（IFA滴度范圍在1：10到1：5120）、RF陽性的33個標(biāo)本（乳膠凝集滴度范圍在1：20到1：640），分別用本試劑盒檢測，結(jié)果均為陰性。有一例標(biāo)本TOXO IgG強陽性（ELISA比率為8.006）及類風(fēng)濕因子強陽性（1：160），用本試劑盒在IgG吸收以前，IgM的檢測結(jié)果為弱至中等陽性（ELISA比率為1：822）。在IgG吸

35、收以后，IgM的ELISA檢測結(jié)果接近于陰性（ELISA比率為0.160）。48個ANA標(biāo)本用本試劑盒檢測，46個結(jié)果為陰性。兩個陽性標(biāo)本中其中之一表現(xiàn)為雜色，滴度為 1：1280，另一個標(biāo)本表現(xiàn)為核內(nèi)模式（1：160）和抗高爾基活性（1：80）。這些試驗結(jié)果表明，RF、EBV-IgM和ANA對本試劑盒的干擾是非常小的。簡明步驟：1. 稀釋血清1：212. 每孔加稀釋過的血清100ml3. 溫育20-30分鐘4. 洗板5. 每孔加結(jié)合劑100ml6. 溫育20-30分鐘7. 洗板8. 每孔加TMB 100ml9. 溫育10-15分鐘10. 每孔加終止液50ml11. 讀數(shù)參考文獻1 Krick

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