2019年整理WesternBlot蛋白提取與樣品制備

1、Western Blot蛋白提取與樣品制備>>»Western Blot第一步便是樣品制備，但是在開(kāi)始制備樣品之前，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)該對(duì)自己的實(shí) 驗(yàn)有一個(gè)非常清晰的思路，通常需要思考的最基本問(wèn)題包括：要檢測(cè)的靶蛋白是否存在該樣Western Blot的有效檢品中？靶蛋白的含量是否在 Western Blot的檢測(cè)下限以上（目前認(rèn)為測(cè)下限為0.1-1 ng） ?要檢測(cè)的靶蛋白在組織或細(xì)胞的哪個(gè)時(shí)期存在？是否需要特殊刺激才會(huì) 表達(dá)？是否只有在病變組織中才會(huì)有表達(dá)？是否存在多種異構(gòu)體？是否容易發(fā)生自行降 解？靶蛋白分子量是不是非常大或者非常?。堪械鞍资欠駜H存在特殊的細(xì)胞器中而需要分 離

2、出細(xì)胞器？充分思考了這些問(wèn)題才有可能對(duì)樣品制備有一個(gè)比較完善的策略。蛋白提取可以分為三個(gè)步驟：第一步獲取材料，第二步分離目的細(xì)胞或組織成份并破碎, 第三步就是進(jìn)行裂解制樣。這里就這三個(gè)步驟展開(kāi)一一討論。材料的獲取 從大方向講，Western Blot的對(duì)象可以是植物組織、動(dòng)物組織和培養(yǎng)物。植物組織的獲取一般應(yīng)該不是很困難，尤其是可進(jìn)行人工種植的植物更是方便。動(dòng)物組織的獲取就相對(duì)困難許多， 一是要考慮到法律上的問(wèn)題，二是需要實(shí)驗(yàn)者有豐富的解剖經(jīng)驗(yàn)，可以快速準(zhǔn)確地從動(dòng)物體上取下需要的組織或Organ（要和諧，下同）。培養(yǎng)物就不用多說(shuō)了，幾乎每個(gè)實(shí)驗(yàn)者都養(yǎng)過(guò)細(xì)菌或者細(xì)胞的。如果是動(dòng)物組織或者植物組織

3、，一般情況下都可以用手術(shù)刀和手術(shù)剪從個(gè)體上分下需要的部份。如果是細(xì)菌，則可以將養(yǎng)好的菌液收集起來(lái)離心，然后棄去上清即可， 如有必要，可以再用等滲中性溶液洗滌數(shù)次。如果材料是培養(yǎng)的細(xì)胞，建議將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶（皿、板）內(nèi)刮下來(lái)再離心處理，也可以不收集采取而直接在培養(yǎng) 容器中裂解，詳見(jiàn)下文。非常不建議用酶將細(xì)胞從培養(yǎng)器皿上消化下來(lái)再進(jìn)行裂解。在組織或者細(xì)胞進(jìn)行裂解之前，一般都要將組織或者細(xì)胞清洗干凈（對(duì)于組織可用預(yù)冷的等滲 buffer洗滌，對(duì)于細(xì)胞也用等滲 buffer洗滌再用離心法去掉洗滌液即可），以除去組織中的 污垢、血液和細(xì)胞培養(yǎng)中的培養(yǎng)基以及添加物。細(xì)胞破碎如果收集到的材料是組織或者Orga

4、n，第一步往往是將它們分切成小塊方便操作。接下來(lái)就是準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞破碎了。細(xì)胞破碎的方法分為機(jī)械法和非機(jī)械法，機(jī)械法可以是振動(dòng)、攪拌、研磨、壓濾、超聲、勻漿，非機(jī)械法可以是干燥、改變滲透壓、凍融、酶 解（纖維素酶、溶菌菌、蝸牛酶）等，不同來(lái)源的材料對(duì)于不同的處理方法耐受程度是不一 樣的，例如超聲波可以很容易破碎動(dòng)物細(xì)胞，但是破碎酵母細(xì)胞就困難許多。在這里有三個(gè)問(wèn)題需要指出：（1）所有的操作盡量在低溫條件下進(jìn)行，防止細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶釋放出來(lái)而 將目的蛋白降解，最好全程都在冰浴中進(jìn)行，有條件用液氮的就用液氮，下同。（2）超聲處理中會(huì)釋放出大量的熱，因此一定需要冰浴。 同時(shí)超聲過(guò)程會(huì)釋放自由基，有可能改

5、變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可向系統(tǒng)中加入少量的GSH （谷胱甘肽）進(jìn)行還原。另外，超聲過(guò)程有可能打斷蛋白質(zhì)大分子，所以如果研究的蛋白質(zhì)分子量比較大時(shí)建議減少超聲處理時(shí)間或者換用 其它方法處理。（3）如果使用蛋白酶處理，可能會(huì)將目的蛋白降解，同時(shí)還引入了新的蛋 白質(zhì)從而干擾實(shí)驗(yàn)， 所以一般不推薦使用。 細(xì)胞的破碎與裂解過(guò)程沒(méi)有嚴(yán)格的時(shí)間和空間界線，其作用僅僅是為了使裂解過(guò)程更容易，因此在破碎細(xì)胞過(guò)程中所用的Buffer 一般也是裂解時(shí)的裂解液，注意不能加太多，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般每克組織加2-3ml裂解液為宜。雜質(zhì)的去除 除了前面獲取材料時(shí)提到的組織中的污垢、血液和細(xì)胞培養(yǎng)中的培養(yǎng)基以及添加物這些雜質(zhì)外，附在組

6、織上的油脂、細(xì)胞外層的細(xì)胞壁、細(xì)胞內(nèi)部的長(zhǎng)鏈DNA等都會(huì)干擾 Western Blot中的SDS-PAGE 一步，因此有必須除去。對(duì)于油脂，一般可以直接離油脂在下層）。對(duì)于細(xì)胞壁，一般在裂解液中的溶 對(duì)于長(zhǎng)鏈DNA，可用鏈霉素使之沉淀再離心除去，DNA，就不會(huì)干擾SDS-PAGE而不用從體系中除心除去（一般以lOOOOg離心10min油脂都會(huì)漂浮在最上層，吸走即可），也可以利用 SiO? 將其吸附而離心除去（lOOOOg, 10min， 解比較差，待裂解完直接離心除去即可。也可以用超聲波處理將其打斷變成小片段 掉。蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的提取過(guò)程,簡(jiǎn)言之就是使細(xì)胞內(nèi)的靶蛋白盡可能都溶解于液相而方便

7、進(jìn)行電泳，其核心思想就是根據(jù)靶蛋白的特性，選擇合適的助溶劑和保護(hù)劑。這一部份涉及到的內(nèi)容比較多，我就一步一步地討論。（1）蛋白質(zhì)的分類 蛋白質(zhì)的分類方法比較多， 可以按照功能分類、 可以按照在細(xì)胞中的 定位分類、可以按照溶解性分類、可以按照三維結(jié)構(gòu)分類。 這里只提按溶解性和在細(xì)胞中 的定位分類法，這兩種分類對(duì)理解蛋白質(zhì)的提取極有幫助。 按照溶解特性分類，蛋白質(zhì)的 分類情況如下：（參閱王鏡巖版生物化學(xué)）1種類1舉例溶解特性1清蛋白1血清白蛋白、卵清蛋白溶于水和中性鹽溶液，不溶于飽和硫酸銨溶液球蛋白1免疫球蛋白、肌球蛋白不溶于水，溶于稀中性鹽溶液，不溶于半飽和硫酸銨溶液谷蛋白1米谷蛋白不溶于水、中

8、性鹽及醇，溶于稀酸、稀堿醇溶谷蛋白1小麥醇溶谷蛋白不溶于水、中性鹽溶液，溶于70-80%乙醇中硬蛋白II角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白不溶于水、稀中性鹽、稀酸、稀堿和一般有機(jī)溶劑1組蛋白II胸腺組蛋白II溶于水、稀酸、稀堿、不溶于稀氨水II精蛋白II魚(yú)精蛋白1II溶于水，稀酸，稀堿、稀氨水II了解了蛋白質(zhì)的溶解特性， 就可以考慮用合適的試劑將蛋白質(zhì)溶解或者將高豐度的蛋白質(zhì) 從體系中除去。按照蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位，籠統(tǒng)上講可以分為三類：膜蛋白、胞漿蛋白（包括內(nèi)膜系統(tǒng)蛋白）和核蛋白。其中膜蛋白的結(jié)構(gòu)相對(duì)來(lái)說(shuō)比較復(fù)雜，是蛋白質(zhì)提取中挑戰(zhàn)最大的一類； 胞漿蛋白則都比較容易提取，它們大多數(shù)可以直接溶于生理鹽

9、溶液中；核蛋白則往往容易形成復(fù)合體或與核酸結(jié)合在一起，同時(shí)組蛋白還含有大量帶正電的組氨酸而在電泳過(guò)程中可能出現(xiàn)電泳速度和預(yù)計(jì)分子量不符的情況。還有（2）蛋白質(zhì)的穩(wěn)定 自從細(xì)胞破裂后，很多蛋白質(zhì)就變得不穩(wěn)定起來(lái)，其中一些蛋白質(zhì)會(huì) 發(fā)生自行降解，另外一些蛋白質(zhì)可能在從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)的蛋白酶的作用下而被水解， 一些在機(jī)械剪切力的作用下發(fā)生斷裂。于是不難理解在進(jìn)行蛋白質(zhì)提取過(guò)程中有這么幾個(gè)因Western blot 的實(shí)在提蛋白過(guò)程中常用的蛋白酶抑制素需要注意：輕柔、低溫、加蛋白本酶抑制劑。輕柔操作這個(gè)就不多說(shuō)了， 動(dòng)作小心點(diǎn)就是， 低溫操作前面也講到過(guò)，全程冰上進(jìn)行是最好的，下面重點(diǎn)說(shuō)說(shuō)蛋白酶抑制劑

10、。首先先來(lái)了 解一下蛋白酶。蛋白酶依據(jù)其活性中心， 可以分為這么幾類： 絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白 酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶（罕見(jiàn)）。另外對(duì)于磷酸化 驗(yàn)，還要考慮磷酸酶。對(duì)于上述不同的蛋白酶目前幾乎都有有效的抑制劑， 加入這些蛋白酶抑制劑可以極有效地防止靶蛋白被內(nèi)源性的蛋白酶降解。劑有以下幾種：絲氨酸蛋白酶抑制劑：P MSF, AEBSF-HCl , Aprotinin , Chymostatin，亮肽素(Leu pep tin )天冬氨酸蛋白酶：PMSF,碘乙酸、抑肽素（Pep stati n）,云芝發(fā)酵物巰基蛋白酶抑制劑：PMSF , TLCK , TPCK , Antip

11、ain-HCI,N-乙基順丁烯二酰亞胺金屬蛋白酶抑制劑（金屬離子螯合劑）：EDTA , EGTA，塔羅肽蘇氨酸蛋白酶：目前缺乏資料磷酸酶抑制劑：NaF，激活的原磯酸鈉（激活方法將在試劑檔案提及）、焦磷酸鈉、 油磷酸鈉。各種蛋白酶抑制劑的使用方法和濃度范圍將在本站試劑檔案欄目中提及，如果您覺(jué)得這些試劑購(gòu)買(mǎi)和配制麻煩，也可以買(mǎi)商品化的雞尾酒系列（cocktail），它們一般包括了大部份的蛋白酶抑制劑種類，使用起來(lái)也極為方便。（3）蛋白質(zhì)裂解液的選擇 對(duì)于水溶性的蛋白質(zhì)提取一般來(lái)說(shuō)都非常簡(jiǎn)單，只需要將細(xì)胞 充分破碎將其釋放出來(lái)即可， 但是對(duì)于一些膜蛋白、 包涵體等難溶的蛋白必須采用助溶劑溶 解。常用

12、的助溶劑有這么幾種：鹽酸胍、尿素、硫脲、稀酸、稀堿、去垢劑（又叫表面活性 劑或去污劑）。需要注意的是用這些方法助溶的蛋白質(zhì)被經(jīng)過(guò)快速稀釋的時(shí)候依然可能出現(xiàn) 沉淀，尤其在跑膠上樣的時(shí)候， 已經(jīng)溶解的蛋白質(zhì)仍然可能變成不溶解的狀態(tài)，因此使用時(shí)建議初步裂解后將初步裂解的樣本離心處理，然后再向不溶成份中加入這些助溶劑，然后再用離心得到的上清緩慢稀釋防止再次沉淀。另外，鹽酸胍溶解的樣品跑膠時(shí)很出現(xiàn)沉淀，慎用；用稀酸溶解的樣品不能進(jìn)行跑膠，因此可能只能作為一種除去非目標(biāo)蛋白的參考手段。 這里重點(diǎn)提一下去垢劑， 在所有助溶劑里去垢劑是最有效的，而且較低的濃度就可以起到很明顯的效果。所有的去垢劑都由兩部份組成，一部份是親水的，一部份是疏水的，在助溶蛋白質(zhì)的過(guò)程中，去垢劑的疏水基團(tuán)一般主要和蛋白質(zhì)結(jié)合，親水基的一端則傾向于溶解在水中。溶于水后能解離成離子的去垢劑叫離子型去垢劑，否則叫非離子型去垢劑， 離子型去垢劑按照水中生成的離子類型又可以分為陽(yáng)離子型去垢劑、陰離子去垢劑和兩性離子去垢劑， 近年來(lái)還發(fā)明了含離子型親水基又有非離子型親水基的混合型去垢劑。在這五種類型的去垢劑中，混合型垢劑垢一般不常用，而陽(yáng)離子型去垢劑不可以用于SDS-PAGE（因?yàn)樗鼈儠?huì)使蛋白質(zhì)帶上正電荷，電泳習(xí)性和SDS-PAGE原理相前背