16SrDNA實(shí)驗(yàn)原理

1、隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，細(xì)菌的分類鑒定從傳統(tǒng)的表型、生理生化分類 進(jìn)入到各種基因型分類水平，如（G+C）mol%、DNA 雜交、rDNA 指紋圖、質(zhì)粒 圖譜和16SrDNA 序列分析等。細(xì)菌中包括有三種核糖體 RNA， 分別為 5SrRNA、 16SrRNA、 23SrRNA ,rRNA 基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成。16SrRNA 對(duì)應(yīng)于基因組 DNA 上的一段基因序列稱 為16SrDNA。5SrRNA 雖易分析，但核苷酸太少，僅幾十 bp,沒有足夠的遺傳 信息用于分類研究；23SrRNA 含有的核苷酸數(shù)幾乎是 16SrRNA 的兩倍，分子量 太大，分析較困難。而 16SrRNA 相對(duì)分子量在

2、 2kb 左右，較為適合 PCR 擴(kuò)增， 又具有保守性和存在的普遍性等特點(diǎn)，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，序列分析的 重現(xiàn)性極高，因此，現(xiàn)在一般普遍采用 16SrRNA 作為序列分析對(duì)象對(duì)微生物進(jìn) 行測序分析。16SrRNA 的編碼基因是 16SrDNA， 但是要直接將 16SrRNA 提取出來很困難，因?yàn)橐妆粡V泛存在的 RNase 降解，因而利用 16SrDNA 鑒定細(xì)菌，其技術(shù)路線如 下：細(xì)胞培養(yǎng)液DNA 提取連接克隆載體陽性克隆鑒-J 定序-DNA聚合酶催化下，以母鏈 DNA 為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板 DNA 互補(bǔ)的子鏈 DNA 的過程。

3、是一項(xiàng) DNA 體外合成放大技術(shù)，能快速特異地 在體外擴(kuò)增任何目的 DNA。、主要器具及試劑PCR、電泳系統(tǒng)、DNA 提取體系、TaqPolymerase DNAMarker，溶菌酶、dNTP1F和感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-TVector、瓊脂糖、SDS 裂解緩沖液、50XTAE 電 泳緩沖液貯存液、1XTE ()三、操作方法1.細(xì)菌基因組總 DNA 的提取接種純化的菌株于 LB 液體培養(yǎng)基中，180r/min, 37C培養(yǎng)過夜，按以下的 方法提取細(xì)菌基因組總 DNA。(1) 菌體收集：取新鮮的菌液于 EP 管中，12000r/min 離心 30s,棄凈上清， 收集菌體。(2) 輔助裂解：加 1

4、00 卩 g/mL 容菌酶 50 卩L37C處理 30min。(3) 裂解： 向每管加入 200mL 預(yù)冷的 SDS 裂解緩沖液， 用吸管頭迅速強(qiáng)烈抽吸以懸浮和裂解細(xì)菌細(xì)胞。向每管加入 66 卩 L5mol/LNaCI,充分混勻后，12000r/min 離心 10min，除 去蛋白質(zhì)復(fù)合物及細(xì)胞壁等殘?jiān)?5) 將上清轉(zhuǎn)移到新 EP 管中， 加入等體積的 Tris-飽和酚，充分混勻，12000r/min離心 3min,進(jìn)一步沉淀蛋白質(zhì)。(6) 取離心后的水層，加等體積的氯仿 /異戊醇(體積比 24： 1)，充分混勻 后，12000r/min 離心 3min，去除苯酚。(7) 小心取上清， 用預(yù)

5、冷 2 倍體積的無水乙醇沉淀 DNA，13000r/min 離心 15min，棄上清。(8) 用 400 卩 L75%勺乙醇洗滌沉淀 2 次。(9) 室溫干燥后，用 40 卩 L1XT 溶解 DNA。(10) %瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組 DNA。(11) 提取的基因組總 DNA-40C冰箱保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增細(xì)菌的 16SrDNA(1) 16SrDNA 的 PCR 引物：采用細(xì)菌的通用引物 27F 和 1492R(2) PCR 反應(yīng)體系為(20:滅菌蒸餾水10Xbuffer2 卩,10mmol/ 卩,27F 和 1492R 引物各 4LDNA 模板譏(3) PCR 反應(yīng)條件：93C預(yù)變性 5min、

6、94C變性 18s、56C退火 15s、72C延伸 78s,循環(huán) 30 次，72C延伸 7min。(4) %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增目的片斷的純化通過 PCR 擴(kuò)增出大量的目的片段,經(jīng) %瓊脂糖凝膠電泳分離后,在紫外燈 下切下含有目的條帶的膠塊裝入的 EP 管中,用 B 型小量 DNA 片段快速膠回收 試劑盒回收 DNA ,操作按說明書進(jìn)行,方法如下：加入 700 Z 溶膠液，55C水浴溶膠，其間偶爾搖動(dòng)，直至膠塊全部溶解。(2) 將溶膠液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000r/min 離心 30s，重復(fù)一次，提高回收率。(3) 向吸附柱中加入 500 漂洗液，12000r/min 離心 30s

7、，倒掉廢液，重復(fù)漂 洗一次。 12000r/min 離心 2min 以完全去除漂洗液。(4) 將吸附柱移至一個(gè)干凈的管中，向吸附柱膜中央加入 40 卩啲洗脫緩沖液，12000r/min 離心 2min 收集 DNA。(5) 回收 DNA 用%瓊脂糖凝膠電泳檢測。目的片斷的克隆PCR 純化產(chǎn)物與 pMD18-T 載體連接體系(10L：膠回收產(chǎn)物 2，MD18-T載體 1(iL，SoulutionI5L無菌去離子水 2L16C連接 4h。轉(zhuǎn)化取 50 卩感受態(tài)細(xì)胞于冰中融化。(2)將 5 Z 連接產(chǎn)物加入到已融化的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吸打混勻，冰浴30min。42C保溫 90s。(4) 冰浴 23m

8、in。(5) 加入 450 ILB 液體培養(yǎng)基，輕輕混勻，200r/min，37C培養(yǎng) 40min。（6）取適量上述培養(yǎng)液均勻涂布在 Amp/X-Gal/IPTG 的 LB 平板上，37C培 養(yǎng)過夜。5.轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（1）重組菌株的菌落 PCR 通過藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，用滅菌的槍頭將白色菌落接種至 4mLLB 液體 培養(yǎng)基 中，200r/min, 37C培養(yǎng) 4h。取菌液作為 PCR 模板。PCR 反應(yīng)體系 （20 卩L： 滅菌蒸餾水 10 沖 CRbuffer （含 15mmol/LMgCI2 ）2L10mmol/卩,卩 mol/L 的上游和下游引物各 4 卩,菌液 2 卩,5U/卩卩。PCR 反應(yīng)條件：93C預(yù)變性 5min、94C變性 18s、56C退火 15s、72C延伸 78s , 循環(huán) 30 次,72C延伸 7min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。（2）重組質(zhì)粒的核苷酸序列的測定對(duì)經(jīng)過鑒定含有目的片斷的單克隆菌液加入甘油 -40C保存，同時(shí)將同一單 克隆菌液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，將測得的序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)測序結(jié)果，用 BLAST 搜索軟件在 NCBI （）的 Gen