兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)活性研究

1、兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)活性研究作者：張晨，王坤正，強(qiáng)輝，時(shí)志斌，黨曉謙，黃向輝【摘要】 目的 體外分離培養(yǎng)、鑒定兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)并探討其分化潛能。方法 應(yīng)用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法，體外分離培養(yǎng)兔骨髓來(lái)源的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程中倒置顯微鏡下觀(guān)察其生物學(xué)特性，HE染色和CD34、CD44免疫組織化學(xué)染色行細(xì)胞學(xué)鑒定；應(yīng)用體外成骨與成脂誘導(dǎo)分化檢測(cè)其生物學(xué)活性。結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)兔BMSCs，HE染色顯示細(xì)胞均一性好；CD44強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，CD34陰性表達(dá)。誘導(dǎo)成骨結(jié)果顯示BMSCs具有較強(qiáng)的成骨活性，ALP染色陽(yáng)性；成脂誘導(dǎo)結(jié)果顯示BMSCs具有較強(qiáng)的成

2、脂活性，油紅“O”脂肪染色陽(yáng)性。結(jié)論 BMSCs體外具有潛在的多向分化能力。 【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；多向分化ABSTRACT: Objective To observe the effect of the in vitro isolation, culture and identification of rabbit bone marrowderived mesenchymal stem cells (BMSCs) and explore the differentiation potentials of BMSCs. Methods BMSCs were isolated a

3、nd purified by density gradient centrifugation combined with attachment culture method. The biological characteristics of BMSCs were observed under an inverted microscope. The BMSCs were identified with HE staining and CD34/CD44 immunohistochemical staining. The biological activity of BMSCs was dete

4、cted by osteogenic induction and steatogenic induction. Results BMSCs were isolated successfully in vitro and had good homogenicity. Immunohistochemical staining of CD34/CD44 showed strong positive expression of CD44 and negative expression of CD34. Fortis osteogenic ability and positive staining of

5、 ALP could be detected by osteogenic induction, and fortis steatogenic ability and positive staining of axungia could be detected by steatogenic induction. Conclusion BMSCs have the capability of multidirectional differentiation in vitro.KEY WORDS: bone marrowderived mesenchymal stem cell; cell cult

6、ure; multidirectional differentiation基因治療過(guò)程中目的基因感染的靶向性成為基因工程研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，選取何種目的細(xì)胞、組織作為基因感染的效應(yīng)器是眾多研究的核心。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells, BMSCs)是一種具有自我更新能力和多向分化能力的干細(xì)胞，在特定條件下可以向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱、脂肪細(xì)胞等分化。將編碼與骨組織再生有關(guān)的生長(zhǎng)因子的基因片段轉(zhuǎn)移到BMSCs中，既能夠誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使之發(fā)揮種子細(xì)胞的作用，又能在體內(nèi)骨組織再生過(guò)程中持續(xù)高效地分泌生長(zhǎng)因子，有利于骨組織的再

7、生修復(fù)和新骨形成。因此，將其作為基因治療宿主細(xì)胞以及組織工程種子細(xì)胞已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法，體外分離培養(yǎng)兔骨髓來(lái)源的BMSCs，培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)用相差顯微鏡及HE染色觀(guān)察細(xì)胞的貼壁、擴(kuò)增、形態(tài)、生長(zhǎng)速度及群體生長(zhǎng)方式等特征，利用細(xì)胞表面抗原免疫組化染色鑒定及誘導(dǎo)成骨、成脂鑒定等方法鑒定培養(yǎng)的BMSCs的特征及純度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的靶細(xì)胞支持。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料2月齡純種新西蘭大耳白兔，雄性，體重1.52.5kg，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基(LGDMEM)、胰蛋白酶、Percoll分離液(1.073g/

8、mL)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CD34、CD44羊抗兔單克隆抗體、鼠抗羊IgGFITC二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 兔BMSCs的分離與培養(yǎng)采用全骨髓密度梯度離心法合并貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs3。取兔的脛骨和股骨，磷酸鹽緩沖液洗去附著的血跡，將其兩端干骺端切除，顯露骨髓腔。用含有100u/L肝素的生理鹽水反復(fù)沖洗骨髓腔，將含有骨髓的沖洗液用DMEM培養(yǎng)基稀釋后,以等體積比緩慢注入裝有已濾菌的Percoll(1.073g/mL)分離液的10mL離心管中，室溫下2000r/min離心30m

9、in。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層加入DMEM低糖培養(yǎng)液中，1200r/min離心10min，反復(fù)兩次，洗凈細(xì)胞懸液中的Percoll分離液。用含100mL/L FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液5mL重懸細(xì)胞，按1×106個(gè)細(xì)胞/cm2接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37、50mL/L CO2飽和濕度孵育箱中行原代培養(yǎng)。48h換液，棄去未貼壁細(xì)胞，此后每3d換液1次。原代培養(yǎng)細(xì)胞12d后細(xì)胞達(dá)80%融合，用2，5g/L胰酶消化后以13的比例傳代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞行下游相關(guān)實(shí)驗(yàn)。1.2.2 兔BMSCs的形態(tài)學(xué)觀(guān)察細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)用相差顯微鏡逐日觀(guān)察體外培養(yǎng)的BMSCs的生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)學(xué)變化，記錄細(xì)

10、胞貼壁、擴(kuò)增、細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度、群體生長(zhǎng)方式等特征。將第3代細(xì)胞常規(guī)制備細(xì)胞爬片，950mL/L乙醇固定行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察BMSCs的形態(tài)、結(jié)構(gòu)并照相記錄。1.2.3 兔BMSCs的細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定以1×105細(xì)胞密度常規(guī)制備細(xì)胞爬片，至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)玻片的80%左右，吸出6孔板中的培養(yǎng)液，PBS沖洗兩遍，每孔加入新配制40g/L多聚甲醛溶液固定30min。PBS洗滌后30mL/L H2O2室溫10min以滅活內(nèi)源性酶，正常山羊血清封閉液室溫孵育30min后分別滴加羊抗兔CD34、CD44一抗，對(duì)照組以PBS代替一抗。4孵育過(guò)夜。次日37復(fù)溫1h，采用SP法檢測(cè)CD34、CD4

11、4的表達(dá)。1.2.4 兔BMSCs誘導(dǎo)成骨分化的生物學(xué)活性常規(guī)制備細(xì)胞爬片。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至40%，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(LGDMEM中含有100mL/L FBS、青霉素100u/mL、鏈霉素100u/mL、甘油磷酸鈉10mmol/L、抗壞血酸50mg/L、地塞米松10nmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)期間應(yīng)用相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及特征。誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后行堿性磷酸酶染色及礦化結(jié)節(jié)染色鑒定細(xì)胞成骨活性變化。1.2.5 兔BMSCs誘導(dǎo)成脂分化的生物學(xué)活性常規(guī)制備細(xì)胞爬片。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至40%，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(LGDMEM中含有100mL/L FBS、青霉素100u/mL、鏈霉素100

12、u/mL、0.5mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、200mol/L吲哚美辛、10umol/L地塞米松、10mg/mL胰島素)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)期間應(yīng)用相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及特征，誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后行油紅“O”染色鑒定細(xì)胞成脂活性的變化。2 結(jié) 果2.1 原代培養(yǎng)的BMSCs的觀(guān)察兔骨髓組織經(jīng)Percoll分離液梯度離心后可形成明顯的分層結(jié)構(gòu)。吸取單核細(xì)胞層細(xì)胞洗滌后接種，24h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，24h后細(xì)胞逐漸由圓形變?yōu)槎趟笮?、紡錘形、多角形；但仍可見(jiàn)少量造血系細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中或沉積于培養(yǎng)瓶底壁，呈圓形散在分布(圖1A)，經(jīng)首次換液后再次觀(guān)察大部分非貼壁細(xì)胞已經(jīng)去除。接種4d后可見(jiàn)較明顯的

13、細(xì)胞集落形成(圖1B)，14d左右，貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶壁的80%左右，將細(xì)胞傳代，傳代細(xì)胞形態(tài)逐漸呈均一的紡錘形和長(zhǎng)梭形，核質(zhì)比大，細(xì)胞分布均勻不再呈集落生長(zhǎng)，細(xì)胞密度增大后多沿胞體長(zhǎng)軸呈有序同向分布，旋渦狀。傳代細(xì)胞增殖速度更快，一般45d可長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部，傳代1次(圖1C)。2.2 原代培養(yǎng)的兔BMSCs的鑒定光學(xué)顯微鏡下HE染色可見(jiàn)：細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大部分呈長(zhǎng)梭形,胞質(zhì)豐富為淡紅色，細(xì)胞核多為卵圓形核漿，分界清晰，位于胞體膨大部的中央，呈藍(lán)色，其中可見(jiàn)處于分裂期的核仁。細(xì)胞形態(tài)與BMSCs形態(tài)一致(圖2A)。以已知CD34、CD44陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照組，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，觀(guān)察到C

14、D44表達(dá)于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)棕黃色，CD34及陰性對(duì)照組無(wú)表達(dá)。CD44陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為91.78%(圖2B、2C)。2.3 誘導(dǎo)成骨分化的相差顯微鏡觀(guān)察鑒定用成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)原代細(xì)胞，培養(yǎng)20d后進(jìn)行ALP染色(Gomori鈣鈷法)鑒定，可見(jiàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，呈現(xiàn)灰黑色顆粒；常規(guī)培養(yǎng)組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)少見(jiàn)灰黑色顆粒(圖3)。茜素紅染色鑒定可見(jiàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞形成粗大的鈣化結(jié)節(jié)，常規(guī)培養(yǎng)組沒(méi)有鈣化結(jié)節(jié)的形成或僅有散在的鈣鹽顆粒形成(圖4)。2.4 誘導(dǎo)成脂分化的相差顯微鏡觀(guān)察鑒定在成脂肪誘導(dǎo)后，細(xì)胞原來(lái)的多角形突觸逐漸回縮，但仍呈多角形，79h時(shí)出現(xiàn)明顯脂滴，脂滴多位于細(xì)

15、胞邊緣(圖5A)。誘導(dǎo)14h后，脂肪細(xì)胞增加，細(xì)胞內(nèi)脂滴密布，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)變圓，多散在分布。油紅“O”染色為陽(yáng)性(圖5B)。3 討論 BMSCs是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在不同理化環(huán)境和細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，可向成骨、成軟骨、脂肪和纖維細(xì)胞系等多方向分化分離、擴(kuò)增，并易于被外源基因感染且穩(wěn)定表達(dá)，是基因治療以及組織工程理想的靶細(xì)胞12。體外如何獲取、純化BMSC并使其高效快速增殖，是利用其治療疾病的前提。細(xì)胞的粘附特性仍是分離和純化BMSCs的最基本原則，物理性富集后塑料器皿內(nèi)的貼壁培養(yǎng)以其經(jīng)濟(jì)實(shí)用、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)仍是分離 BMSCs的最基本方法。 目前用于分離BMSC的方法主要有3種：貼壁篩

16、選法：根據(jù)BMSC具有在塑料組織培養(yǎng)瓶中快速貼壁生長(zhǎng)的特性對(duì)其進(jìn)行篩選；密度梯度離心法：根據(jù)BMSC與其他細(xì)胞密度不同而采用Percoll分離液進(jìn)行密度梯度離心將其分離出來(lái)；磁珠分選法：利用免疫磁珠分離技術(shù)，基于抗體對(duì)細(xì)胞表面抗原的特異識(shí)別，將偶聯(lián)在抗體上的磁珠標(biāo)記在細(xì)胞上，在磁場(chǎng)作用下達(dá)到分離細(xì)胞的目的。單純應(yīng)用某一種方法均具有一定得局限性。貼壁篩選法盡管實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，但是獲得的細(xì)胞純度低，不能滿(mǎn)足組織工程的要求。研究發(fā)現(xiàn)，密度梯度離心法所獲得的細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)于全骨髓貼壁篩選法3。但是我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單純應(yīng)用密度梯度離心法獲得的細(xì)胞數(shù)目較少，原代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)。磁珠分選法盡管分離純度高，但因其需

17、要較高的實(shí)驗(yàn)條件及其成本較高等限制了該方法的普遍應(yīng)用。 本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心和貼壁篩選相結(jié)合的方法，取得了理想的分離效果。由于原代取材抽取的骨髓血包含大量血系細(xì)胞和少量基質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)梯度離心的方法先對(duì)骨髓進(jìn)行分離，可以將絕大部分紅細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血小板去除，獲得純度較高的單個(gè)核細(xì)胞。提取單個(gè)核細(xì)胞層細(xì)胞培養(yǎng)24h待大量細(xì)胞貼壁后，再提前進(jìn)行換液結(jié)合使用貼壁篩選，經(jīng)過(guò)多次換液后即能去除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)懸浮未貼壁的造血細(xì)胞，從而獲得均一性較好的BMSCs。隨著換液與傳代，BMSCs逐漸得到進(jìn)一步純化。目前較常用的分離液有Percoll液、淋巴細(xì)胞分離液等。PITTENGER等4利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)密度梯度

18、培養(yǎng)的第1代和第2代的BMSCs的均質(zhì)性可達(dá)95%和98%。隨著細(xì)胞傳代數(shù)目的增多，非貼壁細(xì)胞逐步去除，基質(zhì)干細(xì)胞的純度也逐步升高，一般認(rèn)為該方法分離培養(yǎng)的BMSCs純度大于70%5。 到目前為止，還沒(méi)有高度特異性的BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，故無(wú)法直接對(duì)其鑒定。對(duì)BMSCs的鑒定主要是采用流式細(xì)胞儀對(duì)其表面抗原進(jìn)行檢測(cè)，再通過(guò)其能向其他細(xì)胞分化而反證。PITTENGER4認(rèn)為稱(chēng)某種或某一群細(xì)胞為BMSCs時(shí)，它必須具有以下特性：骨髓來(lái)源；體外培養(yǎng)貼附于培養(yǎng)皿上形態(tài)呈成纖維樣集落形成單位(CFUF)；能夠自主增殖，至少可以分化為3種以上間質(zhì)細(xì)胞系。BMSCs的細(xì)胞表面標(biāo)記是其與其他細(xì)胞區(qū)分

19、的特異性標(biāo)志。通過(guò)眾多研究結(jié)果的篩選510，發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的CD44表面標(biāo)記的陽(yáng)性表達(dá)與造血系來(lái)源的CD34表面標(biāo)記的隱形表達(dá)是較為肯定的結(jié)論。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法對(duì)二者進(jìn)行了染色鑒定，結(jié)果證實(shí)了CD44分子的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)和CD34分子的陰性表達(dá)。該結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)獲得的目的細(xì)胞純度較高，能滿(mǎn)足下游實(shí)驗(yàn)的要求。 BMSCs具有多向分化潛能，在體外培養(yǎng)時(shí)，為了使BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化，常通過(guò)理化或生物因子等手段促進(jìn)BMSCs的增殖與分化，其中以生物因素最重要和最常用。地塞米松(Dex)雖抑制BMSCs增殖，但可顯著增加BMSCs的堿性磷酸酶(ALP)的活性，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟、誘

20、導(dǎo)成骨。甘油磷酸鈉可為骨細(xì)胞分化和增殖提供磷離子作為堿性磷酸酶作用的底物，誘導(dǎo)和激活堿性磷酸酶，促進(jìn)有機(jī)磷向無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化，能增加ALP在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，從而促進(jìn)生理性鈣鹽的沉積、促進(jìn)鈣化；維生素C可提高ALP的活性、促進(jìn)礦化及膠原mRNA的表達(dá)11。因此，本實(shí)驗(yàn)采用含100mL/L FBS、100nmol/L地塞米松、10mmol/L磷酸甘油酸、50mg/L維生素C的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)成骨后，在相差顯微鏡下觀(guān)察，呈梭形或多角形，具有多個(gè)突起，采用Gomori鈣鈷法ALP染色鑒定顯示，ALP分泌旺盛，成骨性能增強(qiáng)，3周后形成鈣結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出

21、典型的成骨細(xì)胞特性。向生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs中添加了脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑(胰島素、地塞米松以及異丁基甲基黃嘌呤)，發(fā)現(xiàn)作用1周后成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的突觸逐漸回縮，細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭形向橢圓形、多角形轉(zhuǎn)變，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了數(shù)量不等的脂肪滴，聚集在細(xì)胞核周?chē)?，兩周后油紅“O”染色呈陽(yáng)性反應(yīng)。證實(shí)了BMSCs在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑作用下實(shí)現(xiàn)了向脂肪細(xì)胞的定向分化。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法，體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增兔骨髓來(lái)源的BMSCs，培養(yǎng)過(guò)程中相差顯微鏡及HE染色觀(guān)察到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞表面抗原免疫組化染色鑒定顯示獲得的目的細(xì)胞純度較高，誘導(dǎo)成骨成脂鑒定顯示獲得的BMSCs具有典型的干細(xì)胞細(xì)胞特

22、性。制備具有強(qiáng)增殖能力的BMSCs無(wú)疑為組織工程提供了良好的靶細(xì)胞支持，提高了組織工程修復(fù)組織缺損的能力，為骨壞死及骨缺損等疾病的組織工程治療奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1XU WR, ZHANG XR, QIAN H, et al. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro J. Exp Biol Med, 2004, 229(7):623631.2XU W, QIAN H, ZHU W, et al. A nove

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