中國人Rh部分D表型的分子機(jī)理研究

1、中國人Rh部分D表型的分子機(jī)理研究 作者：吳俊杰，洪小珍，許先國，何吉，傅啟華，嚴(yán)力行【摘要】 為了研究部分D表型的分子機(jī)理，用間接抗人球蛋白方法(IAT)篩選弱表達(dá)的D變異體，PCR-SSP（polymerase chain reaction-sequence sepecific primer）方法擴(kuò)增RHD基因特異的外顯子及其側(cè)翼序列，用PCR產(chǎn)物直接序列分析測(cè)定核苷酸的變異。結(jié)果表明：從22例弱D中檢測(cè)到10例部分D表型，其中D Va（Kou.）、D Va（Hus.）和D Va-like （YH.）各1例，D VI type 表型7例。結(jié)論：10例部分D表型的分子機(jī)理得到明確，其中D V

2、a（Kou.）、D Va-like （YH.）表型為國內(nèi)首次報(bào)道。 【關(guān)鍵詞】 Rh血型Molecular Basis of Partial D Phenotypes in ChineseAbstract To investigate the molecular basis of partial D phenotypes in Chinese，D variants with weak D expression was screened by using indirect anti-human globulin test ( IAT) method，the polymerase chain re

3、action-sequenc specific primer (PCR-SSP) method was employed to amplify RHD specific exons and their flanking regions. The amplification products were sequenced directly to determine the molecular basis of D variants. The results showed that ten cases of partial D phenotypes，including one case of D

4、Va（Kou.），one case of D Va（Hus.），one case of D Va-like （YH.），and seven cases of D VI type ，were detected from 22 cases of weak D phenotype respectively. All ten cases of partial D phenotypes had one RHD allele deleted. In conclusion，the molecular basis of ten cases of partial D phenotype was confirme

5、d，including D Va（Kou.）and D Va-like （YH.）phenotypes reported firstly in Chinese population.Key words Rhesus blood group; RHD gene; partial D; sequencingRh血型系統(tǒng)是目前已知的29個(gè)人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最復(fù)雜的一個(gè)1。Rh血型的核心抗原包括RhD和RhCE（主要有ce、Ce、CE、cE 4種組合）蛋白，它們分別由1條417個(gè)氨基酸組成的肽鏈所編碼。疏水性分析表明，它們都包括6個(gè)胞外環(huán)、12個(gè)跨膜區(qū)域和7個(gè)胞內(nèi)環(huán)。RhD和RhCE多肽鏈僅有30-

6、35個(gè)氨基酸的差異。D 抗原因?yàn)榫哂休^強(qiáng)的免疫原性在臨床上有重要的意義。對(duì)D抗原表位的分類已經(jīng)從最初的7個(gè)細(xì)分到37個(gè)1。通過鑒定這些表位，可以明確部分D的具體表型。但是，目前針對(duì)這些表位的一系列單克隆抗體譜散布于國外一些大型的輸血醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)和血型參比實(shí)驗(yàn)室中，只有通過國外會(huì)議交流或者私人贈(zèng)送的途徑才能獲得。因此，單克隆抗體的匱乏影響了部分D表型的血清學(xué)鑒定。另外一個(gè)有效的途徑是從基因水平去研究D變異體的分子機(jī)理，明確其變異位點(diǎn)，從而鑒定部分D。目前，D變異體的分子機(jī)理研究已經(jīng)有很多報(bào)道，但是對(duì)部分D表型的分子機(jī)理研究主要集中在白人、非裔黑人和日本人中，在中國人群中的相關(guān)研究報(bào)道很少1。我們

7、從弱D中通過分子水平的研究鑒定了10例部分D表型，報(bào)道如下。材料和方法研究對(duì)象以工作或者生活在浙江省的無償獻(xiàn)血員為研究對(duì)象。在2002-2004的3年研究期間，共收集到Rh陰性樣本1 272例。根據(jù)抗D試劑說明，對(duì)Rh陰性血型做進(jìn)一步的IAT實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，篩查得到22例弱D樣本。對(duì)弱D樣本做RHD基因序列分析，發(fā)現(xiàn)其中10例為部分D表型，12例為弱D表型。 本研究以10例部分D表型為研究對(duì)象。Rh表型血清學(xué)鑒定RhD表型鑒定采用常規(guī)鹽水平板法或試管法，使用加拿大Dominion公司的NAVACLONETM混合單克隆抗D試劑（人單克隆IgM抗D，D175-2細(xì)胞株；人單克隆IgG抗D，D415 1E

8、4細(xì)胞株）。根據(jù)試劑說明，鹽水實(shí)驗(yàn)Rh陰性的Rh血型用IAT方法進(jìn)一步確認(rèn)。如果IAT實(shí)驗(yàn)陽性，并且直接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)陰性，則鑒定為弱D表型或者部分D表型；如果IAT實(shí)驗(yàn)陰性，則鑒定為Rh陰性?？谷饲虻鞍自噭┯妹绹鳬mmuco公司的兔源抗IgG。RhC、Rhc、RhE和Rhe鑒定采用鹽水試管法，試劑為加拿大Titus公司的單克隆抗體。基因組DNA提取采用Puregene DNA 純化試劑盒 (Gentra，Minneapolis，USA)，從枸櫞酸鈉抗凝的外周血中制備基因組DNA，嚴(yán)格按試劑說明書操作。D雜合性檢測(cè)和單倍體型推測(cè)根據(jù)Perco等的方法2，用特異性引物u1-s和rnb31 PCR

9、檢測(cè)Rhesus hybrid box。如果可以擴(kuò)增得到2 778 bp的特異性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失；反之，則不存在Rhesus hybrid box，沒有RHD基因的缺失。最大可能的單倍體型根據(jù)RHCE基因的C/c和E/e等位基因和RHD基因是順式共遺傳，并且RHD基因缺失的單倍體型按cde推算。PCR-SSP參照Wagner等3和Legler等4的方法，根據(jù)RHD基因和RHCE基因內(nèi)含子序列的差異設(shè)計(jì)10組特異擴(kuò)增，包括RHD 基因外顯子及其側(cè)翼序列的PCR-SSP引物（表1）。PCR反應(yīng)總體積50 l，含模板DNA 1 l（約25-50 n

10、g），特異性引物終濃度250 nmol/L，MgCl2 終濃度1.5 mmol/L（TaKaRa公司，中國大連），dNTP終濃度 200 mol/L (Promega公司，美國)，Taq酶1 U（TaKaRa公司）。PCR擴(kuò)增條件：95 預(yù)變性5分鐘，然后94 變性30秒、64 (外顯子1、2、3、7)/67 (外顯子4、6、8、9、10)/ 60 (外顯子5)退火30秒和72 延伸1分鐘，循環(huán)35次，最后72延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增儀為PE2700（Applied Biosystems公司，美國）。Table 1. Primers used in specific amplification

11、 and sequencing of RHD exons and their flanking regions（略）PCR產(chǎn)物直接測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒 (Qiagen GmbH，德國)純化后，直接用于序列分析反應(yīng)。序列分析反應(yīng)采用“BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit”試劑盒，DNA聚合酶采用AmpliTaq DNA Polymerase（Applied Biosystems公司，美國），最后用ABI 377 測(cè)序儀 (Applied Biosystems公司，美國)作序列分析。結(jié)果D雜合性檢測(cè)10例部分D都可以擴(kuò)增得到2 778

12、 bp的特異性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失。10例部分D的分子鑒定通過對(duì)RHD基因特異的外顯子及兩翼序列的擴(kuò)增和序列分析，我們共檢測(cè)到4類部分D的等位基因（表2）。Table 2. Molecular basis of ten partial D phenotypes in Chinese（略） 第1類等位基因有外顯子5的667 T>G和697 G>C突變（圖1），引起RhD蛋白第7個(gè)跨膜區(qū)域的223 Phe>Val和第4胞外環(huán)的233 Glu>Gln氨基酸的突變。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這是D Va（Kou

13、.）表型5。只1例，可能的單倍體型為CDVae/cde。 第2類等位基因攜帶外顯子5的667 T>G，676 G>C，697 G>C，712 G>A，733 G>C，744 C>T，787 G>A，和 800 A>T，共8個(gè)突變（圖1），引起編碼的RhD蛋白7個(gè)氨基酸突變（744C>T為無義突變）：223 Phe>Val、226 Ala>Pro、233 Glu>Gln、238 Val>Met、245 Val&

14、;gt;Leu、263 Gly>Arg和267 Lys>Met，其中226 Ala>Pro、233 Glu>Gln、238 Val>Met突變位于RhD蛋白的第4胞外環(huán)，223 Phe>Val和245 Val>Leu突變位于跨膜區(qū)域，263 Gly>Arg和267 Lys>Met 突變位于胞內(nèi)環(huán)。推測(cè)是RHD基因的整個(gè)外顯子5通過RHD和RHCE基因的基因轉(zhuǎn)換被RHCE基因外顯子5替換所致，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這是D Va（Hus.）表型5。只1例，可能的單倍體型為CDVaE

15、/cde。 第3類等位基因攜帶外顯子5的667 T>G，676 G>C，697 G>C，712 G>A，733 G>C，和744 C>T，共 6個(gè)核苷酸突變（圖1），產(chǎn)生223 Phe>Val、226 Ala>Pro、233 Glu>Gln、238 Val>Met和245 Val>Leu，共5個(gè)氨基酸突變（744C>T為無義突變）。其中226 Ala>Pro、233 Glu>Gln、238Val&am

16、p;gt;Met突變位于RhD蛋白的第4胞外環(huán)，223 Phe>Val和245 Val>Leu突變位于跨膜區(qū)域。推測(cè)也是由RHD/RHCE基因外顯子5的基因轉(zhuǎn)換所致。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道6，這是D Va-like （YH.）表型。只1例，可能的單倍體型為cDVaE/cde。 第4類等位基因用PCR-SSP擴(kuò)增RHD基因的外顯子3-6呈陰性反應(yīng)，外顯子1、2、7、8、9和10（包括3非翻譯區(qū)）及其側(cè)翼序列未見變異。推測(cè)RHD基因的外顯子3-6被對(duì)應(yīng)的RHCE基因替換，或者被替換的是RHD基因外顯子2-6。根據(jù)Wagner3和Legler等4，7報(bào)道的PCR-SSP反應(yīng)格局，這

17、是DVI type 表型。共7例，單倍體型CDDVae/cde。討論決定D抗原特異性的氨基酸主要位于外顯子4、外顯子5和外顯子7編碼的D蛋白的第3、第4和第6胞外環(huán)8。這些胞外環(huán)氨基酸的單個(gè)或者多個(gè)錯(cuò)義突變以及RHD基因和RHCE基因外顯子3-7之間的基因轉(zhuǎn)換使得D蛋白特異的胞外環(huán)的氨基酸被CE蛋白的對(duì)應(yīng)部分取代是構(gòu)成部分D表型的兩個(gè)主要分子機(jī)理。因?yàn)槿笔抗原特異的氨基酸所編碼的D表位，部分D的血清學(xué)特征為表達(dá)不完整的D抗原，如果受到D陽性細(xì)胞（或者攜帶自身所缺失的表位的D細(xì)胞）刺激，會(huì)產(chǎn)生針對(duì)缺失表位的抗體。準(zhǔn)確鑒定部分D表型對(duì)于指導(dǎo)臨床輸血和育齡婦女采取恰當(dāng)?shù)念A(yù)防新生兒溶血病措施等有重要

18、的意義1。 本研究運(yùn)用RHD基因測(cè)序方法，從弱D樣本中鑒定了10例部分D，其中D Va（Kou.）、D Va（Hus.）和D Va-like （YH.）各1例，D VI type 表型7例。D Va（Kou.）和D Va-like （YH.）表型為國內(nèi)首次報(bào)道。D雜合性分析發(fā)現(xiàn)，10例部分D表型均有RHD基因的缺失，即各部分D等位基因均為半合子。這和國外報(bào)道的弱D和部分D表型先證者的D雜合性結(jié)果一致8。 D Va表型包括了D Va（Kou.）、D Va（Hus.）、D Va（To.）、D Va（SM.）和D Va-like（YH.）5種亞型，其共同特點(diǎn)是Rh23抗原陽性，由部分或者全部RHD基

19、因的外顯子5被RHCE基因相應(yīng)部分替換引起，都有233 Glu>Gln的氨基酸替換，該突變位于RhD蛋白中對(duì)表位表達(dá)很重要的第4胞外環(huán)，從而影響D抗原表位的完整性。 在日本西部大阪地區(qū)檢測(cè)到的部分D中有44是D Va9，我們的結(jié)果中D Va占了部分D的30，其中D Va（Kou.）表型只有223 Phe>Val和233 Glu>Gln氨基酸的替換。223 Val位于RhD蛋白的跨膜區(qū)域，可能影響D抗原量的表達(dá)。D Va（Hus.）表型和D Va-like （YH.）表型分別攜帶外顯子5的8個(gè)和6個(gè)核苷酸突變，其中744 C>T為沉默突變。

20、這2種部分D都有位于RhD蛋白第7和第8跨膜區(qū)域的223 Phe>Val和245 Val>Leu替換，可能是這兩個(gè)表型D抗原密度下降的原因所在。位于RhD蛋白的第4胞外環(huán)的226 Ala>Pro、233 Glu>Gln和238 Val>Met替換可能影響D抗原表位的完整性。但是D Va（Hus.）比D Va-like （YH.）多了2個(gè)位于胞內(nèi)環(huán)的263 Gly>Arg和267 Lys>Met 替換，這是這2個(gè)表型分子水平的區(qū)別。 本研究用于特異擴(kuò)增RHD外顯子5的PCR-SSP上游引物位于RHD

21、內(nèi)含子4的區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物中檢測(cè)到D Va（Hus.）的RHD外顯子5的7個(gè)特異性氨基酸都被RHCE特異的氨基酸替換，這和Shao等10認(rèn)為D Va（Hus.）的整個(gè)RHD外顯子5和內(nèi)含子5都被RHCE基因相應(yīng)部分替換的結(jié)果一致。 國外對(duì)D VI的研究比較深入，已經(jīng)確認(rèn)D VI表型都是RHD和RHCE基因轉(zhuǎn)換引起，并非RHD外顯子的缺失7，11。我們檢測(cè)到的7例部分D的外顯子3-6的PCR-SSP反應(yīng)呈陰性，根據(jù)Legler和Wagner等報(bào)道的PCR-SSP反應(yīng)格局，我們判斷該7例部分D為D VI type ，并且7例D VI type 的單倍體型為CDVIe，和國外報(bào)道一致。 中國香港特區(qū)弱

22、D表型約占隨機(jī)人群的0.01612。在日本西部（大阪）部分D表型約占人群的0.0007，日本東北部部分D表型約占0.0067，有顯著性差異9。D VI type 是歐洲人中臨床意義最大的部分D表型，約占英國人群的0.04，德國人群的0.02，而荷蘭人群中的比例大于德國的3倍之多，各地分布有顯著性差異1。我們的數(shù)據(jù)表明，如果按照Rh陰性在隨機(jī)人群中的比率為0.4計(jì)算，浙江地區(qū)弱D表型約占隨機(jī)人群的0.0069，D Va表型約占隨機(jī)人群的0.00094，D VI type 在隨機(jī)人群中約占0.0022，部分D表型在隨機(jī)人群中約占0.0031。浙江人群弱D表型和D VI type 表型的頻率均分別低

23、于中國香港、德國等地的相應(yīng)人群頻率。但是部分D表型在浙江人群中的頻率介于日本的西部（大阪）和東北部的部分D表型的人群頻率之間?？梢娙鮀和部分D在隨機(jī)人群中的頻率因地區(qū)或者人種不同有較大的差異。 除了DNB等因D抗原密度沒有明顯下降而和抗D在鹽水中反應(yīng)呈陽性的部分D表型外，大部分部分D表型在D表位缺失的同時(shí)還伴隨著D抗原密度的下降，在IAT實(shí)驗(yàn)中呈陽性結(jié)果1。因此，雖然弱D和部分D血清學(xué)的定義并不相同，臨床上檢測(cè)到的弱D常包括部分D7。當(dāng)鑒定部分D的單克隆抗體缺乏或者是極弱表達(dá)的D抗原（不能用單克隆抗體鑒定表位）時(shí)，從基因水平鑒定弱D樣本，從而鑒定出部分D表型也是一個(gè)很有效的研究部分D的策略。本

24、研究鑒定了10例部分D的分子機(jī)理，并推算了相關(guān)的人群頻率數(shù)據(jù)，對(duì)促進(jìn)針對(duì)D變異體的基因分型策略的完善、指導(dǎo)臨床輸血工作和育齡婦女的抗D免疫預(yù)防、RHD基因的進(jìn)化、變異規(guī)律和D蛋白的生物學(xué)功能等研究有重要的意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Daniels G. Human blood groups. 2nd ed. Oxford: Alden Press Ltd. 2002: 195-2732Perco P，Shao CP，Mayr WR，et al. Testing for the D zygosity with three different methods revealed altered Rhesu

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