miR21在白血病發(fā)病過程中的作用研究

1、miR21在白血病發(fā)病過程中的作用研究 作者：張帥 王萍玉 尹娟 李有杰 馬穎 謝書陽 【摘要】 目的 本實驗旨在研究miR21在白血病細胞中表達情況，探討miR21基因與白血病發(fā)病的關(guān)系。方法 提取組織中的小于200 bp的RNA,用poly(A)聚合酶在其3末端加尾，再用5帶40 nt延伸序列的單堿基錨定OligdT引物進行反轉(zhuǎn)錄，然后用特異引物進行realtime PCR擴增，從而檢測部分miRNAs在白血病細胞株K562中的表達，并與正常人骨髓表達情況相對比。結(jié)果 通過realtime PCR 分析，癌基因miR21在K562細胞中的表達量約為(1.73±0.24）×

2、;105 個拷貝，明顯高于正常人骨髓組織中miR21的表達（P0.01）。結(jié)論 本研究表明miR21在K562細胞中的表達量增高，可能在白血病的發(fā)生過程中起重要作用。 【關(guān)鍵詞】 實時定量PCR；miR21；白血??；基因表達 【Abstract】 Objective Studing the expression of miR21 in leukemia cells to explore the relationship between miR21 and development of leukemia. Methods After less than 200bp miRNA was isola

3、ted and added with poly A at 3 UTR by polymerase A, the miRNA was reversely conscripted by using 40 nt specific primers for realtime PCR at 5 end. Then, the expression of miR21 was detected in K562 cells and bone marrow cells of health people.Results The expression level of miR21 in K562 cell was (1

4、.73±0.24）×105 copies, obviously higher than that in health people bone marrow cells by realtime PCR analysis（P0.01）.Conclusion The study demonstrated that the expression of miR21 was upregulated in leukemia cells,which may play an important role in leukemia development. 【Key words】 reatime

5、 PCR, miR21,leukemia，gene expression MicroRNA (miRNA)是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，大小約為2125個堿基的單鏈小分子RNA。miRNA能調(diào)節(jié)生物體生長、發(fā)育和疾病發(fā)生過程中有關(guān)基因的表達1，2，推測這種小分子調(diào)控人類近1/3的基因，平均每個miRNA可調(diào)節(jié)人類200種不同的mRNA表達，并且多個miRNA能夠協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)一些特殊的靶基因3。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在正常血細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用，因此miRNAs的異常表達可能與血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。 目前，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展和靶基因?qū)嶒灥拇_定，有助于揭

6、示miRNAs在調(diào)控正常血細胞分化以及相關(guān)血液系統(tǒng)腫瘤中的詳細分子機制，miRNAs的檢測有望成為某些血液系統(tǒng)腫瘤的診斷方法，miRNAs及其靶基因的表達控制也可能成為治療某些血液系統(tǒng)腫瘤的手段。本研究旨在應(yīng)用realtime PCR研究miR21在白血病細胞中表達情況，探討其與白血病發(fā)病的關(guān)系。 1 材料與方法 1.1 細胞培養(yǎng) K562細胞用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37 條件下培養(yǎng)。正常人的骨髓細胞由山東省煙臺山醫(yī)院提供。 1.2 小RNA的提取 用mirVanaTMmiRNA提取分離試劑盒 (Ambion公司) 從白血病細胞株K562細胞中分離小片斷RNA(200

7、nt)。按說明書步驟，從1×106個細胞中提取出小片段RNA溶解在30 l的無RNA酶水中，紫外分光光度計定量。 1.3 miRNA的克隆和逆轉(zhuǎn)錄 取1.5 gRNA和5U多聚（poly）腺苷酸(A)聚合酶置于50 l反應(yīng)管中，37條件下30 min進行小RNA的多聚腺苷酸化。將帶有poly(A)尾的小RNA溶于適量無RNA酶H2O中，在20 l體積中，應(yīng)用GeneRacer試劑盒SuperScriptTMRT部分進行反轉(zhuǎn)錄：10 l帶有poly(A)尾的小RNA在1 l反轉(zhuǎn)錄引物5GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)243、1 l dNT

8、P混合物(10 mmol/L)和1 l無菌蒸餾水的孵育作用下，65條件下5 min，冰浴1 min，加入5×buffer 4 l，0.1 mol/L DTT 1 l，200 U/l反轉(zhuǎn)錄酶1 l，加水至20 l，42，1 h。最后，反轉(zhuǎn)錄酶在70條件下孵育15 min滅活。準(zhǔn)備cDNA擴增。 1.4 PCR檢測目的miRNA 取上述逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行PCR擴增：引物：上游引物P1：5TAGCTTATCAGACTGATGT3；下游引物P2：5CGACAGTTGCTATGCGATGCA3。 反應(yīng)條件：94 預(yù)變性3 min，1個循環(huán)；94 變性30 s，60 退火30 s，72 延

9、伸20 s，30個循環(huán)； 72 延伸10 min，1個循環(huán)，瓊脂糖凝膠分離DNA片段。 1.5 realtime PCR反應(yīng) (SYBRGreen Kit4) 標(biāo)準(zhǔn)品制備：將上述PCR產(chǎn)物連接到T載體上（Invitrogen公司），篩選含有插入片段的載體，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copies/l，使用realtime PCR儀測定定量曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。 反應(yīng)條件：realtime PCR使用RG3000 system (Corbett Research)，變性:95 10 min，延伸95 30 s

10、，68 30 s，72 30 s，40個循環(huán)，測定吸光值。 2 結(jié)果 2.1 RTPCR檢測miR21在K562細胞中的表達 結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR21在K562細胞中表達量相對較高，見圖1。 2.2 克隆的質(zhì)粒DNA鑒定 提取經(jīng)篩選的用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線模板的質(zhì)粒DNA,經(jīng)過PCR及酶切證實,目的片段已連接至T載體上（圖2）。 2.3 realtime PCR 檢測miR21在K562細胞中的表達 檢測癌基因miR21的表達量約為(1.73±0.24）×105 個拷貝（表1），明顯高于對照組。 表1 定量PCR檢測miRNA表達量結(jié)果 3 討論 檢測miRNA的方法包括Norther

11、n blotting5，mirVanaTM miRNA Detection (Ambion公司產(chǎn)品)，microarray6等，這些基于分子雜交的方法敏感性低，需要的RNA量較大。RTPCR方法是目前檢測基因表達最靈敏、可靠的方法，但miRNAs分子太小，用常規(guī)的RTPCR檢測有局限，需要特殊的設(shè)計。 實時熒光定量 PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑，利用熒光信號實時檢測PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。1991年Holland等7首先報道了運用不可延伸的寡核苷酸雜交探針與模板相結(jié)合，然后利用DNA聚合酶53核酸外切酶的活性將探針切斷，使探針的能量傳遞結(jié)構(gòu)破壞發(fā)

12、出熒光來定量PCR產(chǎn)物。1996年P(guān)E公司在Holland等運用方法的基礎(chǔ)上開發(fā)出商用實時熒光定量PCR系列，即Taqman PCR系列。實時熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ?、靈敏、快速、高重復(fù)性地精確定量起始模板濃度。 研究表明，miR21在膠質(zhì)母細胞瘤中表達增加，這個基因在腫瘤組織中表達量比正常組織高5100倍。反義核酸的研究發(fā)現(xiàn)這個miRNA 通過抑制凋亡而并非影響細胞增殖控制細胞生長，這預(yù)示著這個miRNA具有癌基因的功能。Volinia等對肺癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，miR20a、miR21、 miR175p等與腫瘤的發(fā)生呈正相關(guān)。對惡性膽管細胞癌研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞中miR21、m

13、iR141等表達明顯增高，而抑制miR21的表達可以增加腫瘤對化療藥物吉西他濱（gemcitabine）的敏感性9。上述研究說明miR21作為癌基因在多種腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用。 本文通過定量PCR實驗，檢測了miR21在白血病細胞和正常人骨髓細胞中表達的差異，發(fā)現(xiàn)miR21在白血病細胞胞株K562細胞中的表達量增高，推測miR21參與白血病的發(fā)生，在白血病的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。 【參考文獻】 1 Xie X,Lu J,Kulbokas EJ,et al.Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters an

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