基因重排檢測(cè)技術(shù)的建立及其在淋巴瘤診斷中的應(yīng)用(一)

1、基因重排檢測(cè)技術(shù)的建立及其在淋巴瘤診斷中的應(yīng)用(一 )作者：朱少君，李艷紅，張偉，王旭霞，鞏麗，李?lèi)?ài)寧,蘭淼【關(guān)鍵詞】淋巴瘤 Detectionandclinicalsignificanceofgenerearrangementsindiagnosisoflymph omas 【Abstract】AIM:ToestablishawaytodetectthegenerearrangementsofIgHandTCRandtoas sesstheapplicationofthedetectiontechniqueinthediagnosisofmalignantlym phoma.METHODS:

2、Fiftythreecasesofmalignantlymphomaand20casesofreac tivelymphoidhyperplasiawerechosenformakingtissuesections.GenomicDN Awasextracted,andamplifiedviaPCR.Theproductswereresolvedondenaturin gpolyacrylamidegelsandvisualizedthroughsilverstaining.RESULTS:Generearr angementsofIgHandTCRwerenegativein20caseso

3、freactivelymphoidhyperpl asia.Inallof18casesofTcellnonHodgkinslymphoma(TNHL),generearrangeme ntofTCR 丫 wasfoundin12casesandthatofTCR B wasfoundin3cases,andIgHgene rearrangementwasnotfound.IgHgenerearrangementwasfoundin28casesou tof32casesofBcellNHL(BNHL),in2casesofwhichgenerearrangementsofTCR丫ndIgHw

4、erebothfound.TherewasIgHgenerearrangementin3casesofsuspecte dlymphomas.TherewasaremarkabledifferencebetweenNHLgroupandbenig ngroupingenerearrangment(P0.05).CONCLUSION:Thedetectionofgenerearr angementsofIgHandTCRbyPCRcanbeakindofsubsidiarymeanstodiagnoseth elymphoproliferativedisease.Particularly,the

5、clonalityshowedintheformalinf ixedandparaffinembeddedsamplesmaybeusefulintheretrospectiveresearch es.【Keywords】lymphoma;generearrangement;polymerasechainreaction;neoplasm 【摘要】目的：建立基于克隆性分析技術(shù)的B 和 T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗原受體分子基因重排檢測(cè)技術(shù)，探討B(tài) 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白及T 淋巴細(xì)胞受體基因重排在惡性淋巴瘤臨床診斷中的應(yīng)用.方法：從組織蠟塊中切取組織片510張，提取基因組DNA, PCRT增，聚丙烯酰胺凝

6、膠電泳后銀染顯示基因重排結(jié)果.結(jié)果：20例良性淋巴組織反應(yīng)性增生病例中，淋巴細(xì)胞IgH及TCRS因重排均為陰性；18例T細(xì)胞非何杰金氏 淋巴瘤中TCR基因重排12例,TCR理因重排3例，未見(jiàn)有IgH基因重 排；32例B細(xì)胞性非何杰金氏淋巴瘤標(biāo)本中有 28例IgH基因重排陽(yáng)性， 有2例TCR和IgH基因重排均陽(yáng)性；3例未確診的疑難病例均為IgH 基因重排；IgH及TCRS因重排檢出率在淋巴瘤組與良性組之間，差異有顯著意義(P0.05)結(jié)論：應(yīng)用PCR法檢測(cè)B淋巴細(xì)胞IgH和T淋巴細(xì) 胞TCR基因重排可作為淋巴細(xì)胞來(lái)源的良、惡性病變的一種輔助診斷 手段，且適用于石蠟標(biāo)本以進(jìn)行回顧性研究.【關(guān)鍵詞】

7、淋巴瘤；基因重排；聚合酶鏈反應(yīng)；腫瘤0 引言惡性淋巴瘤(malignantlymphoma)是免疫系統(tǒng)的原發(fā)性惡性腫瘤，主要發(fā)生于淋巴器官和淋巴組織.根據(jù)腫瘤的組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞學(xué)特征可分為何杰 金 氏 病 ( Hodgkinsdisease,HD) 及 非 何 杰 金 惡 性 淋 巴 瘤( nonHodgkinsmalignantlymphoma,NHL) ，淋巴瘤的診斷一直是病理診斷中的難點(diǎn)，部分淋巴組織增生性病變單純通過(guò) HE和免疫組化很難明 確性質(zhì)，另外NHL由于種類(lèi)繁多，分類(lèi)復(fù)雜，給臨床病理工作者帶來(lái) 了一定的困難.淋巴細(xì)胞從原始的胚系構(gòu)型到分化成熟，其抗原受體(Ig和TCR基因通 過(guò)基

8、因重排而形成有功能的基因.一個(gè)T, B細(xì)胞或其克隆性后代，均只 含一種獨(dú)特的分子遺傳學(xué)標(biāo)記.一旦某一克隆的淋巴細(xì)胞發(fā)生惡性變化即可呈現(xiàn)特異的基因重排1 .因此,對(duì)基因重排類(lèi)型進(jìn)行檢測(cè)可用于對(duì)淋巴細(xì)胞增殖性疾病的診斷.此研究擬應(yīng)用這一手段，探討淋巴組織增生性病變的性質(zhì)，并對(duì)該技術(shù)在惡性淋巴瘤中的診斷價(jià)值進(jìn)行探討.1 材料和方法1.1 材料 53 例惡性淋巴瘤標(biāo)本均來(lái)自第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院病理科( 19952005) .其中男性29例 ( 55%) ， 女性 24例 ( 45%) ； 年齡 1276歲， 平均年齡44.2歲 .所有標(biāo)本均為福爾馬林固定、石蠟包埋組織.其中B細(xì)胞非何杰金淋巴瘤32例，

9、T細(xì)胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴組織增生性病變3 例 .20例良性淋巴組織反應(yīng)性增生病例作為陰性對(duì)照.所有淋巴瘤病例均在取 PCR模板前經(jīng)臨床病理HE和免疫組化 標(biāo)記(B細(xì)胞:CD20,CD79%注田胞:CD3,CD45RO證實(shí)，以確定為相應(yīng)病 例且所取部位確為病變部位，包含有需檢測(cè)的部分.3 例未能定性的淋巴組織增生性病變懷疑為BNHL鈍疫組化標(biāo)記CD7%陽(yáng)性），但診斷仍未.1.2 方法1.2.1 石蠟包埋組織DNA的提取每例標(biāo)本制備厚度為4”的切片6張， 貼于載玻片上，常規(guī)烤片、二甲苯脫蠟、乙醇沖洗，切片自然干燥.用無(wú)菌雙面刀片將組織刮入1.5mL的離心管中，按以前的方法2-3提

10、 取基因組DNA.1.2.2 引物合成引物序列由上海生工生物工程技術(shù)公司合成.引物序列為：B 球蛋白基因內(nèi)對(duì)照PC03： ACACAACTGTGTTCACTAGPC04:CAACTTCATCCACGTTCAC施疫球蛋白基因重排（IgH）FR3A: ACACGGCTGTGTATTACT， GTLJH ： TGAGGAGACGGTGAC， C VLJH： GTGACCAGGGTACCTTGGCCC CA©田胞受體基因重排 （TCR B鏈和 丫 鏈 ）Db1:CAAAGCTGTAACATTGTGGG， GAJbC2:AGCACTGTGAGCCTGGT，GCC TVG:AGGGTTGTGTT

11、GGAATCA， GTGJX:CGTCGACAACAAGTGTTGTTC， CAC V 11:TCTGGAGTCTATTACTGTG C V 101:CTCACACTCTCACTTC J 丫 12:CAAGTGTTGTTCCACTGCC2:GTTACTATGAGCTAGTCC.123PCRT增及循環(huán)條件PCRT增在PT200型熱循環(huán)儀（MJResearch 上進(jìn)行.反應(yīng)體系為 25W含10mmol/LdNTP （GibcoBRL 2«l 10登 沖液 2.5 wL 50mmol/LMgCl20.75wI, TaqDNA聚合酶（GibcoBRL 1U, 20pmol/L引物1門(mén)DNA樣

12、品15區(qū)L.IgH!因采用半巢氏PCR擴(kuò)增:第 一輪引物為FR3A和LJH,95c預(yù)變性3min,然后94c變性40s,62c退火50s,72c延伸40s共30個(gè)循環(huán);最后72c延伸10min.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 ： 100 稀釋后取1M進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，引物為FR3A和VLJH,95S預(yù)變性3min, 然后94 c變性40s,60c退火50s,72c延伸40s共30個(gè)循環(huán);最后72 c 延伸10min.FR3A與VLJHT增產(chǎn)物為100120bp.TCRB和TCRyM用40個(gè)循環(huán) 淇中TCR刊物為 V 11 VT 01和J 丫 12 V 11V丫 10和Jp12的混合物.95C預(yù)變性3min,然后9

13、4c變性40s,56c 退火50s,72c延伸40s;最后72c延伸10min.TCRB擴(kuò)增產(chǎn)物為65 85bp.TCR各組擴(kuò)增產(chǎn)物在 70200bp不等.B球蛋白基因引物作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)贈(zèng)，共40個(gè)循環(huán).95C預(yù)變性3min, 然后94c變性40s,60c退火50s,72c延伸40s;最后72 c延伸10min. 產(chǎn)物長(zhǎng)度為110bp.1.2.4 電泳及結(jié)果觀察瓊脂糖凝膠(20g/L)電泳評(píng)價(jià)擴(kuò)增效果后，將3 w L 產(chǎn)物和等體積的上樣緩沖液4(990mL/L甲酰胺，1g/L澳酚藍(lán)，1g/L 二甲苯青)混勻后加到厚度為 0.8mm的聚丙烯酰胺凝膠(100g/L,含 尿素 8mol/L),應(yīng)用 miniVE 系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotecf)泳動(dòng) 8h (80V).取出后按以前的方法2銀染，分別用UVP凝膠分析系統(tǒng)(UVP