實(shí)驗(yàn)六 微生物細(xì)胞大小測(cè)定和微生物顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

1、實(shí)驗(yàn)六 微生物細(xì)胞大小測(cè)定和微生物顯微鏡直接計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解目鏡測(cè)微計(jì)和鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)的構(gòu)造。2掌握用顯微測(cè)微計(jì)測(cè)量微生物細(xì)胞大小的方法。3. 了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、原理和使用方法。4. 掌握應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定青霉菌孢子濃度的方法。實(shí)驗(yàn)材料：1菌種 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）24h液體培養(yǎng)物；青霉菌（Saccharomyces cerevisiae）斜面培養(yǎng)物2其它普通光學(xué)顯微鏡、鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)、接目測(cè)微計(jì)、蓋玻片、載玻片、香柏油、滴管、血球計(jì)數(shù)板、滴管、擦鏡紙。實(shí)驗(yàn)原理：在一定條件下，各種微生物細(xì)胞的大小，是微生物形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。由于微

2、生物細(xì)胞很小，只能在顯微鏡下測(cè)量，一般采用顯微測(cè)微計(jì)來(lái)測(cè)量。顯微測(cè)微計(jì)有鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)和接目測(cè)微計(jì)兩個(gè)部件。鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)是在中央部分刻有精度等分線的載玻片。一般將1mm等分為100格，每格長(zhǎng)度為10mm，用于校正接目測(cè)微計(jì)。接目測(cè)微計(jì)可直接用于測(cè)量細(xì)胞的大小。它是一塊可放在目鏡內(nèi)的圓形玻片，其中央一般有100等分的小格，每小格代表的長(zhǎng)度隨目鏡、物鏡放大倍數(shù)的大小而改變。通常必須以鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)來(lái)校準(zhǔn)，從而計(jì)算出在一定的接物鏡和接目鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，接目測(cè)微計(jì)每格的實(shí)際代表長(zhǎng)度，最后方可利用接目測(cè)微計(jì)直接測(cè)量被測(cè)對(duì)象的長(zhǎng)度和寬度。顯微直接計(jì)數(shù)法，即利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法

3、，各種單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液、菌體較大的酵母菌、霉菌孢子、放線菌和真菌的原生質(zhì)體等均可采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將孢子懸液（或菌懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室內(nèi)，由于載玻片上的計(jì)數(shù)室蓋上蓋玻片后的容積（0.1mm3）是一定的，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目換算為單位體積內(nèi)的微生物數(shù)目。樣品中菌（或孢子）數(shù)（個(gè)/ml）每小格的平均數(shù)´ ´稀釋倍數(shù)在這一公式中，1000代表1ml的容積（即1000mm3），0.00025為每一小格的容積（即0.00025mm3），上面公式可進(jìn)一步改寫為：樣品中菌（或孢子）數(shù)（個(gè)/ml）每小格的平均數(shù)´稀釋倍數(shù)&#

4、180;4´106實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1. 微生物細(xì)胞大小測(cè)定（一）目鏡測(cè)微計(jì)的校正1放置目鏡測(cè)微計(jì)取出接目鏡，旋開接目透鏡，將接目測(cè)微計(jì)放在目鏡的隔板上（有刻度的一面向下），然后旋上接目鏡，最后將此接目鏡插入目鏡鏡筒內(nèi)。2放置鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)把鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)放在顯微鏡載物臺(tái)上（有刻度的一面向上）。3校正接目測(cè)微計(jì)用低倍物鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，通過(guò)調(diào)焦能看清鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)的刻度；移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)和轉(zhuǎn)動(dòng)接目測(cè)微計(jì)使兩者刻度平行；轉(zhuǎn)動(dòng)推進(jìn)器從而使兩測(cè)微計(jì)某段起、止線完全重合，數(shù)出兩條重合線之間的格數(shù)。用同法分別校正在高倍鏡和油鏡下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的長(zhǎng)度。4計(jì)算接目測(cè)微計(jì)每格的相對(duì)長(zhǎng)度接目測(cè)微計(jì)每格的長(zhǎng)度（mm）

5、（二）測(cè)定啤酒酵母細(xì)胞的大小取下鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)，將用壓滴法制成的啤酒酵母水浸片放在顯微鏡載物臺(tái)上，用高倍鏡觀察，調(diào)至物象清晰后，轉(zhuǎn)動(dòng)接目測(cè)微計(jì)，測(cè)量酵母菌細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度分別占有幾個(gè)格數(shù)，再將測(cè)得的格數(shù)乘以接目測(cè)微計(jì)每格的相對(duì)長(zhǎng)度即可求出酵母菌細(xì)胞的大小。要求在同一張片上測(cè)定1020個(gè)酵母細(xì)胞并求出平均值，這樣才能代表酵母細(xì)胞的平均大小。最后取出目鏡測(cè)微計(jì)，將接目測(cè)微計(jì)和鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)分別用擦鏡紙擦拭后放回干燥處保存。2. 微生物顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（一）青霉菌孢子懸液的制備1取一支孢子成熟的青霉菌斜面培養(yǎng)物，用無(wú)菌移液管吸取5ml無(wú)菌水加入菌管中。2采用無(wú)菌操作技術(shù)，用接種環(huán)將菌管內(nèi)斜面上的孢子輕輕刮下

6、，注入到盛有玻璃珠的三角瓶中，同樣方法將另15ml無(wú)菌水分三次再加入菌管中，將剩余的孢子全部刮干凈，將孢子液全部合并于三角瓶中，水平旋轉(zhuǎn)振蕩30min，然后倒入含有脫脂棉的無(wú)菌漏斗中過(guò)濾，得單孢子懸浮液。（二）顯微鏡下孢子濃度測(cè)定1稀釋定量取出孢子懸液，加到無(wú)菌干燥的試管中，按照一定倍數(shù)將其稀釋，稀釋的程度一般以血球計(jì)數(shù)板每小格內(nèi)含有510個(gè)菌或孢子最為合適。2加樣取潔凈干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，用無(wú)菌滴管從蓋玻片的邊緣滴一滴孢子稀釋液，則孢子稀釋液自行滲入，注意不要產(chǎn)生氣泡。3計(jì)數(shù)靜止5min，使孢子沉降不再流動(dòng)，然后即可在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室的位置，然后換成高倍鏡計(jì)數(shù)。如發(fā)現(xiàn)孢子懸液太濃或太稀釋，應(yīng)重新稀釋并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要