硅膠吸附柱色譜技術(shù)實(shí)際應(yīng)用

1、硅膠吸附柱色譜技術(shù)實(shí)際應(yīng)用0 管理提醒： 本帖被 迷路的小孩 執(zhí)行加亮操作(2007-07-18色譜法從發(fā)明到現(xiàn)在已有八十多年的歷史.它是純化和分離有機(jī)或無(wú)機(jī)物的一種方法.色譜法按固定相的狀態(tài)可分為柱色譜.平板色譜和棒色譜三種而實(shí)驗(yàn)室中最常用的是柱層析和薄層層析,以及它們之間的配合應(yīng)用.1柱層析21 吸附色譜地原理2操作步驟2.1 硅膠準(zhǔn)備3硅膠一般選用250-400目(即40-63m直徑的硅膠顆粒),根據(jù)Rf選用硅膠的用量.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器準(zhǔn)備 一支玻璃色譜柱,一個(gè)鐵架臺(tái),燒杯,錐形瓶,徑口直徑較大的玻璃漏斗,一支玻璃棒,2.3 裝柱4 吸附劑的加入干法：將吸附劑一次加入色譜管，振動(dòng)管壁使其

2、均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入開始層析時(shí)使用的流動(dòng)相，或?qū)⑸V管下端出口加活塞，加入適量的流動(dòng)相，旋開活塞使流動(dòng)相緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤(rùn)濕下沉，在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層。操作過(guò)程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。濕法：將吸附劑與流動(dòng)相混合，攪拌以除去空氣泡，徐徐傾入色譜管中，然后再加入流動(dòng)相，將附著于管壁的吸附劑洗下，使色譜柱表面平整。 俟填裝吸附劑所用流動(dòng)相從色譜柱自然流下，液面將柱表面相平時(shí)，即加試樣溶液.試樣的加入將試樣溶于層析時(shí)使用的流動(dòng)相中，再沿色譜管壁緩緩加入。注意勿使吸附劑翻起。或?qū)⒃嚇尤苡谶m當(dāng)?shù)娜軇┲?。與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散

3、狀；將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。2.4洗脫 5除另有規(guī)定外，通常按流動(dòng)相洗脫能力大小，遞增變換流動(dòng)相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時(shí)，再改變流動(dòng)相的品種和比例。操作過(guò)程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。2.5 檢測(cè) 初步檢測(cè) 當(dāng)沖洗溶劑流出一定量后,可對(duì)流出液進(jìn)行初步檢測(cè),并且將錐形瓶更換成小試管進(jìn)行收集.一般只進(jìn)行初步的快捷檢測(cè),因此通常是取一小薄層板,用鉛筆和直尺將硅膠板分劃成多個(gè)小方塊,并安一定的次序編號(hào).取一根內(nèi)徑為0.3mm左右的玻璃毛細(xì)管蘸取少量流出

4、液,點(diǎn)于薄層板的一個(gè)小格內(nèi),待半點(diǎn)干后,然后用物理的或化學(xué)的方法檢測(cè). 正式檢測(cè) 點(diǎn)樣: 取分部收集的沖洗溶液進(jìn)行分別直接點(diǎn)樣,如果沖洗溶液太稀,濃度太小,可先濃縮.點(diǎn)樣的容器一般用玻璃毛細(xì)管,點(diǎn)樣斑點(diǎn)的直徑一般為3-5mm. 展開:在普通的展開槽中進(jìn)行,展開方式常選用上行展開. 展開劑:實(shí)用沖洗溶液.2.6 合并 根據(jù)上面薄層檢測(cè)的結(jié)果,我們可以將具有相同Rf指的部分進(jìn)行合并,然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)合并部分進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),最后得到我們需要的目標(biāo)產(chǎn)物.2.7色譜柱的洗滌3 色譜柱的選擇柱子可以分為：加壓6，常壓7，減壓8。壓力可以增加淋洗劑的流動(dòng)速度，減少產(chǎn)品收集的時(shí)間，但是會(huì)減低柱子的塔板數(shù)。所

5、以其他條件相同的時(shí)候，常壓柱是效率最高的，但是時(shí)間也最長(zhǎng)，比如天然化合物的分離，一個(gè)柱子幾個(gè)月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺(jué)能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過(guò)硅膠會(huì)使溶劑揮發(fā)（有時(shí)在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時(shí)使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時(shí)間長(zhǎng)）。以前曾經(jīng)大量的過(guò)減壓柱，對(duì)它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓后，就幾乎再也沒(méi)動(dòng)過(guò)減壓的念頭了。加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過(guò)外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過(guò)大，

6、不然溶劑走的太快就會(huì)減低分離效果。個(gè)人覺(jué)得加壓柱在普通的有機(jī)化合物的分離中是比較適用的。常壓柱色譜，又稱柱層析，是色譜法中最常見(jiàn)的一種。它的突出優(yōu)點(diǎn)是，分離效率比經(jīng)典的化學(xué)分離方法高的多，與其他色譜法相比，不需要昂貴的儀器設(shè)備，更換流動(dòng)相和吸附劑方便，消耗材料少，成本低，適合分離取樣量從克到微克級(jí)范圍很寬的各種樣品，因此在化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中至今仍被廣泛應(yīng)用。4 溶劑的選擇 1溶劑的選擇也許是整個(gè)柱色譜分離操作中最困難之處,也是實(shí)驗(yàn)成功的最關(guān)鍵之處.溶劑通常先利用簡(jiǎn)便的硅膠薄層色譜進(jìn)行篩選.4.1 薄層色譜點(diǎn)樣94.2 展開10展開劑選擇11 選擇展開劑時(shí),可采用微量圓環(huán)法和小型色譜法進(jìn)行選擇. 微量

7、圓環(huán)法:將欲分離的物質(zhì),按常規(guī)方法點(diǎn)在薄板,兩點(diǎn)相距2-3cm小型色譜法.用普通的載薄片制成薄板,把欲分離的物質(zhì)點(diǎn)載薄板上,放于小型玻璃缸或廣口瓶中展開,干燥后顯色,觀察斑點(diǎn)分離情況. 展開薄層色譜的展開方法有上行法,下行法,雙向展開法,徑向展開法等 上行法:使展開劑由下向上爬. 下行法:使展開劑由上向下.該法可使用極性較弱的展開劑. 雙向展開法:取方形薄板像紙色譜一樣進(jìn)行雙向展開. 徑向展開法:可將吸附劑涂成圓形或扇形,在圓心部分加如展開劑,使薄層徑向展開. 梯度展開:該法所用的展開劑在連續(xù)不斷的改變組成.一般可把一個(gè)裝有強(qiáng)極性展開劑的滴定管深入密閉的含弱極性的展開劑的層析槽中,槽中用電磁攪

8、拌器把滴下的強(qiáng)極性展開劑混勻,此時(shí),展開劑的極性逐漸由弱變強(qiáng),使極性差別較大的多種組分混合物得以很好的分離.4.3 顯色12 展開后,如物質(zhì)有色,可明顯的在薄層上觀察到它們的位置.如無(wú)色,則要通過(guò)一定的方法顯色,定位,一邊確定斑點(diǎn)的位置及大小.4.4常用溶劑的極性13常用溶劑的極性順序：石油醚環(huán)己烷/己烷苯乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水?？坍嫎O性一般用介電常數(shù)：石油醚（無(wú)）（環(huán)）己烷（1.88）苯（2.3）乙醚（4.5）氯仿（5.2）乙酸乙酯（6.1）丙酮 （21.5）乙醇（25.8）甲醇（31.2）水（81.0）。在薄層色譜中,當(dāng)溶劑的極性太大時(shí).會(huì)使待分離物全部接近溶劑前沿,當(dāng)溶劑的

9、極性太小時(shí),又會(huì)使待分離物幾乎全部保留在圓點(diǎn),這兩種情況都是待分離物得不到分離.使用單一溶劑，往往不能達(dá)到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個(gè)高極性和低級(jí)性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，常用的溶劑組合有：Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate4 柱色譜應(yīng)用實(shí)例5.1 薄層色

10、譜法和柱層析法分離蘭州紅心蘿卜色素的研究14利用薄層色譜法和柱層析法對(duì)紅心蘿卜中的色素進(jìn)行分離分析，著重研究了色素的量、洗脫劑、洗脫時(shí)間等因素對(duì)色素分離的影響。選擇了以硅膠G為固定相，無(wú)水乙醇/水(5：1，v/v)的混合液作洗脫劑的最佳條件，單向一次性進(jìn)行色譜分離。5.2 常壓硅膠柱層析分離制備高純貝殼杉烷型二萜從半邊旗(Pteris semipinnata L，PSL)提取物中分離高純度貝殼杉烷型二萜化合物，建立了分離工藝條件。以TLC實(shí)驗(yàn)篩選適當(dāng)?shù)南疵摿鲃?dòng)相，常壓硅膠柱層析分離純化，產(chǎn)物用兩相法重結(jié)晶，TLC及Ms監(jiān)測(cè)分離效果及產(chǎn)品純度。結(jié)果表明優(yōu)選的流動(dòng)相為混合溶劑石油醚：丙酮：醋酸一7

11、：3：005(體積比)，純化分離得到兩個(gè)貝殼杉烷型二萜單分子化合物，純度分別從62和17提高到96和94 。5.3 減壓硅膠柱層析分離苦豆子系列生物堿利用硅膠柱層析法純化苦豆子中含有的生物堿，以氯仿、甲醇為洗脫劑，通過(guò)改變2種溶劑的混合比例進(jìn)行洗脫，得到了苦參堿、氧化苦參堿和其它生物堿的單體，鑒于其它生物堿無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品，故本文未加以討論?？鄥A、氧化苦參堿的得率分別為222 、426，其單體通過(guò)HPLC檢測(cè)后，純度都達(dá)到95以上，因此可以應(yīng)用硅膠柱層析法精制苦豆子中含有的生物堿。5.4 中壓柱層析法分離白藜蘆醇的研究15對(duì)虎杖中的白藜蘆醇進(jìn)行了提取分離和含量測(cè)定?？疾炝私釡囟?、浸提液濃度、浸提時(shí)間和次數(shù)、料液比等5個(gè)因素對(duì)白藜蘆醇提取的影響，確立了白藜蘆醇最佳提取條件為：浸提液體積分?jǐn)?shù)為95 ，浸提溫度60 ，料液比11：1，回流提取3次，每次60 min。采用中壓硅膠柱層析法分離白藜蘆醇，產(chǎn)物經(jīng)重結(jié)晶后用高效液相色譜測(cè)定含量達(dá)9928 。結(jié)果表明所建立的制備及分離純化工藝可用于白藜蘆醇的生產(chǎn).5.5 干柱層析法制備油茶總皂苷對(duì)照品初探16研究干柱層析法制備油茶皂苷對(duì)照品的