生物大分子實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、高級(jí)生物化學(xué)與分子生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊蕴囟富蛟诖竽c桿菌中的克隆、表達(dá)和純化為主線，進(jìn)行基因操作、蛋白質(zhì)表達(dá)、親和層析純化等的訓(xùn)練，通過(guò)集中訓(xùn)練熟練生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，為獨(dú)立開(kāi)展研究生課題研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2、 實(shí)驗(yàn)原理利用基因重組技術(shù)，將目的基因與載體質(zhì)粒DNA在體外進(jìn)行重組，然后把這種重組DNA轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)一定的誘導(dǎo)條件，使之在受體細(xì)胞內(nèi)增值表達(dá)相應(yīng)的目標(biāo)蛋白。為了得到相應(yīng)的目標(biāo)蛋白，需要通過(guò)親和層析等手段純化目標(biāo)蛋白。三、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 一）內(nèi)容一：重組質(zhì)粒的分離、鑒定與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1. 重組質(zhì)粒的分離、純化及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)2. 質(zhì)粒的酶切及瓊脂糖凝膠電泳回收實(shí)驗(yàn)3

2、. 感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接與轉(zhuǎn)化 二）內(nèi)容二：重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)4. 細(xì)菌的大量培養(yǎng)及重組蛋白的誘導(dǎo) 三）內(nèi)容三：重組蛋白的提取、純化與鑒定 實(shí)驗(yàn)5. 細(xì)菌的收集、破碎與目標(biāo)蛋白的純化實(shí)驗(yàn)6.目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE鑒定 實(shí)驗(yàn)1 質(zhì)粒DNA的分離、純化及檢測(cè)材料、設(shè)備及試劑一、材料 轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，1.5ml塑料離心管,離心管架。 二、設(shè)備 微量取液器(20l,200l,1000l)， 臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽滅菌鍋，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。三、試劑 1. LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ：稱(chēng)取蛋白胨(Tryptone)5

3、g，酵母提取物(Yeast extract) 2.5g，NaCl 5g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5, 加去離子水至總體積500 mL，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。2. LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。 3. 氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20保存?zhèn)洹?. 質(zhì)粒提取試劑盒。操作步驟 1. 細(xì)菌的培養(yǎng)和收集 將含有質(zhì)粒的菌種用無(wú)菌牙簽挑取平板上的單菌落接種到2-5ml LB液體培養(yǎng)基(含50g/ml Amp)中，37振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。 2. 取液體培養(yǎng)物1.2 mL于Eppendorf

4、 管中，然后6000 g/min離心2 min，棄上清。3. 質(zhì)粒的提取，參照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明。4 -20保存DNA以備電泳檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)2 質(zhì)粒的酶切及瓊脂糖凝膠電泳回收 材料、設(shè)備及試劑 一、 材料 質(zhì)粒； Hind酶及其酶切緩沖液；瓊脂糖(Agarose) 二、 設(shè)備 水平式電泳裝置,電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī), 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀。 三、 試劑 50×TAE電泳緩沖液； 6×電泳載樣緩沖液。操作步驟 一、 DNA酶切反應(yīng) 1. 反應(yīng)體系組成： 10X Buffer 5 L HindIII 1 L Plasmid 20 L H2O 24 L

5、2. 混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf管置于泡沫板上，37水浴保溫1小時(shí)，使酶切反應(yīng)完全。 3. 停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?二、 瓊脂糖凝膠電泳 1. 取50×TAE緩沖液4ml加水至200ml，配制成1×TAE稀釋緩沖液，待用。 2. 膠液的制備：稱(chēng)取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 1×TAE稀釋緩沖液，輕輕搖勻，溶脹30min，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化。3. 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽放好，插上樣品梳子。將冷卻至50-60的瓊脂糖膠液小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。 4. 加樣：取10l酶解液與2l 6×

6、;載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。5. 電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。6. 染色觀察和拍照。7. 回收條帶，用回收試劑盒。步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)3 感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接與轉(zhuǎn)化 材料、設(shè)備及試劑 一、材料E. coli BL21/DE3菌株: Amp-；無(wú)菌eppendorf管。 2、 試劑LB液體培養(yǎng)基、T4 DNA連接酶、氨芐青霉素、含Amp的LB固體培養(yǎng)基操作步驟一、 連接反應(yīng) 1. 取新的經(jīng)滅菌處理的1.5ml eppendorf管, 編號(hào)。 2. 體系組成：共

7、10lBuffer 1X回收的DNA片段 100 ngT4 DNA ligase 1 L去離子水 3. 順序：去離子水、回收的DNA片段、回收的DNA片段、T4 DNA ligase。4. 混勻后用小離心機(jī)將液體全部甩到管底,于16保溫8-24h。2、 E. coli感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化1. 從4冰箱中取200l感受態(tài)細(xì)胞懸液，立即置冰上。2. 加入連接產(chǎn)物溶液(體積不超過(guò)10l)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。 3. 42水浴中熱擊90秒,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。 4. 向管中加入0.8ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37低轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)45min，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)

8、粒編碼的抗生素抗性基因。5. 將上述菌液搖勻后取200l 涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置5-10min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)16-24小時(shí)。 同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照: 對(duì)照組1: (-)感受態(tài)細(xì)胞，此組正常情況下應(yīng)不產(chǎn)生菌落。 對(duì)照組2: （+）1l質(zhì)粒，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量。 實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的大量培養(yǎng)及外源蛋白的誘導(dǎo) 操作步驟 種子培養(yǎng)液的準(zhǔn)備和外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 1. 取凍存的菌種，接種入裝有5-10ml LB培養(yǎng)基的瓶中，37，200rpm/min過(guò)夜培養(yǎng)后接入100ml LB培養(yǎng)基，接種濃度為2%。 2. 37，200rpm/min培養(yǎng)3小時(shí)后，將搖床溫度調(diào)

9、節(jié)到誘導(dǎo)溫度20并平衡30min，然后加入IPTG至終濃度0.4mM，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌的收集、破碎與目標(biāo)蛋白的純化材料及試劑 一、材料 經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的大腸桿菌、Ni-NTA介質(zhì)（Ni親和介質(zhì)） 二、試劑 1緩沖液: 20mmol/L Tris-HCl，pH8.0；2緩沖液配制10mM、50 mM、100 mM、250 mM咪唑。操作步驟一（細(xì)菌破碎） 1.將菌液轉(zhuǎn)入大離心瓶中，離心收菌，4000rpm，10min；2.倒掉上清，將菌體懸于10mL緩沖液中 ，超聲破碎細(xì)菌；3.將破菌產(chǎn)物離心，12000rpm，15 min；4. 分別對(duì)上清和沉淀留樣，通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

10、鑒定表達(dá)情況和蛋白操作步驟二（目標(biāo)蛋白純化）1.處理介質(zhì)：向柱中加入0.5mL NiTA介質(zhì)后，用5倍柱體積的去離子水洗滌介質(zhì)；再用5倍柱體積的緩沖液洗滌介質(zhì)； 以下步驟根據(jù)蛋白性質(zhì)在16下進(jìn)行操作；2.加入蛋白樣品：加入超聲破菌后的蛋白上清樣品；3.洗滌雜蛋白：用5倍柱體積的10mM咪唑洗滌介質(zhì)；4.洗滌目標(biāo)蛋白：用50 mM、100 mM、250 mM不同濃度的咪唑各2.5ml，梯度洗脫介質(zhì) ，回收流出液，保存于4，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)六目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE鑒定 試劑 10十二烷基硫酸鈉（SDS）貯存液、30%丙烯酰胺單體液、濃縮膠緩沖液1M pH6.8的Tris

11、緩沖液和分離膠緩沖液1.5M pH8.8的Tris緩沖液、10%過(guò)硫酸銨、TEMED、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、樣品處理液、染色液、脫色液操作步驟一、 蛋白電泳用膠的配制 1. 安裝玻璃板。2. 按表1中給出的數(shù)值在一小燒杯中配制分離膠溶液。 表2-1 SDS不連續(xù)電泳凝膠配方貯液分離膠/12%濃縮膠/3%30%丙烯酰胺單體貯液/mL4.00.85分離膠緩沖液1.5M Tris/mL (pH8.8)2.5-濃縮膠緩沖液1M Tris /mL(pH6.8)-0.6雙蒸水/mL3.43.510的SDS溶液/L1005010的過(guò)硫酸銨溶液/L158TEMED/L108 3. 迅速在玻璃板的間隙中灌

12、注丙稀酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所需的空間。再在膠面上小心注入一層水（約23 mm）高，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。4. 分離膠聚合完全后（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。5. 按表1中給出的濃縮膠配置方法制備濃縮膠。注意一旦加入TEMED，馬上開(kāi)始聚合，故應(yīng)快速操作。6. 在聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈梳子。7. 在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行處理，在樣品中按1：1體積比加入樣品處理液，在100加熱5min以使蛋白質(zhì)變性。8. 濃縮膠聚合完全后（30-60 min），小心移出梳子。將凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。二、上樣

13、電泳1. 按預(yù)定順序加樣，加樣量通常為10 25L。電泳檢測(cè)樣品至少包括：蛋白Marker、上樣液（原液）、上樣后的穿透液、10mM咪唑沖洗液、50mM咪唑沖洗液、100mM咪唑沖洗液、250mM咪唑沖洗液。2. 將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/ cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15 V/ cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm，然后關(guān)閉電源。3. 從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開(kāi)玻璃板。緊靠最左邊一孔凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。三、用考馬斯亮藍(lán)對(duì)SDS聚丙稀酰胺凝膠進(jìn)行染色和脫色染色時(shí)間：現(xiàn)溫度下不少于2h。脫色需310小時(shí)，期間應(yīng)多次更換脫色液直

14、至背景清楚。為了永久性記錄，應(yīng)盡快對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1、 質(zhì)粒的提取、酶切電泳圖譜M21 圖 1-1 第四組電泳圖譜 圖1-2 第三組電泳圖譜1：酶切后的質(zhì)粒 2：質(zhì)粒 M ：Marker 1、2：質(zhì)粒 4、5：酶切后質(zhì)粒觀察結(jié)果：通過(guò)對(duì)比第三組和第四組電泳圖譜，可以發(fā)現(xiàn)酶切后的質(zhì)粒條帶在原質(zhì)粒條帶的前面，并且質(zhì)粒泳道條帶比較多；電泳條帶模糊，呈凹凸形狀，拖尾現(xiàn)象比較嚴(yán)重，不能很明顯地觀察結(jié)果。 原因分析： （1）質(zhì)粒泳道條帶較多的原因可能是，質(zhì)粒有的是超螺旋的，有的可能是開(kāi)環(huán)質(zhì)粒，還有的形成各種聚合物，因此呈現(xiàn)多條條帶。由于形成聚合物，分子量增大，因此條帶在酶切條帶的后面，

15、條帶最亮說(shuō)明呈聚合狀態(tài)的質(zhì)粒的量是最多的。 （2）Marker條帶模糊，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重可能的原因有：電泳緩沖液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，可以提高電泳效果；瓊脂糖的濃度可能不是很適合，應(yīng)盡可能摸索出該質(zhì)粒最適濃度；電泳時(shí)電壓不是最適電壓，而且電壓不是很穩(wěn)，電泳時(shí)間太長(zhǎng)，可能是電泳儀器太老化了；正確合適的上樣量是條帶清晰的保證，條帶模糊可能是上樣量太大；有時(shí)候可能是由于DNA被蛋白質(zhì)或一些酶污染。2、轉(zhuǎn)化結(jié)果（培養(yǎng)基） 陽(yáng)性對(duì)照是將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。我們組的菌落效果總體比其他小組好，這與涂布平板時(shí)的一些注意事項(xiàng)有關(guān)，比如涂板的時(shí)候溫度不要太高，無(wú)菌操作等。陽(yáng)性對(duì)照 實(shí)驗(yàn)組菌落很多

16、，說(shuō)明菌液濃度有點(diǎn)高，但是還是有明顯的單菌落。但是菌落培養(yǎng)時(shí)間有點(diǎn)長(zhǎng)，影響因素可能有培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量等等。實(shí)驗(yàn)組 陰性對(duì)照是將酶切以后沒(méi)有連接的質(zhì)粒用于感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。由于細(xì)菌本身對(duì)外源DNA有降解作用，因此目標(biāo)基因在細(xì)菌里不能表達(dá)，因此不能看到菌落。陰性對(duì)照3、目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜1）電泳檢測(cè)樣品包括：蛋白Marker、上樣液（原液）、上樣后的穿透液、50mM咪唑沖洗液、100mM咪唑沖洗液、250mM咪唑沖洗液。2）各個(gè)小組將100mM咪唑沖洗液在一塊膠上一起電泳。3）只有第二小組做了對(duì)照電泳，將未加IPTG誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行了相應(yīng)的電泳。穿柱液4333kD4

17、5kD21M 圖3-1目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜以Marker為臨界線，右邊是我們第四組的電泳圖譜，左邊是第三組的電泳圖譜。1：破菌后的原液 2：50mM咪唑沖洗液 3：100mM咪唑沖洗液 4：250mM咪唑沖洗液 我們以第三組的穿柱液作為標(biāo)本圖3-2 對(duì)照組，未加IPTG誘導(dǎo)1：原液 2：穿透液3：50mM咪唑洗脫液4、100mM咪唑洗脫液5、250mM咪唑洗脫液結(jié)果分析： 1）通過(guò)SDS-PAGE鑒定圖譜3-1我們可以看出，通過(guò)IPTG的誘導(dǎo)，我們成功得到了目標(biāo)蛋白。通過(guò)與Marker標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)比，可以看到目標(biāo)蛋白分子量在33kD-45kD之間；原液中含有大量的目標(biāo)蛋白，穿柱液中沒(méi)有，說(shuō)明目標(biāo)蛋白被吸附到了層析柱中。通過(guò)第三組和第四組結(jié)果的比對(duì)，可以看到第四組在不同濃度咪唑洗脫液得到的目標(biāo)蛋白的量比第三組多，有可能是因?yàn)榈谒慕M加樣量多于第三組，或者是50mM沒(méi)有完全洗脫便開(kāi)始100mM咪唑進(jìn)行洗脫。 2）我們從圖譜中可以看出目標(biāo)蛋白在50mM咪唑洗脫液和100mM咪唑洗脫液中被洗脫下的量是比較多的，因此我們可以在50-10mM之間尋找最適咪唑液的濃度。3）圖3-2是未加IPTG誘導(dǎo)