海藻多糖對(duì)HL-60細(xì)胞體外增殖的影響

1、海藻多糖對(duì) HL-60 細(xì)胞體外增殖的影響作者：林新梅 王國(guó)祥 陸羨 唐慎華【關(guān)鍵詞】海藻【摘要】目的探討海藻多糖對(duì)人 HL- 6 0細(xì)胞增殖的影響。方法采用集落培養(yǎng)、 MTT 、形態(tài)觀察等方法，研究海藻 多糖對(duì) (HL- 60)體外增殖的影響。結(jié)果海藻多糖對(duì)體外培養(yǎng)的 HL- 6 0細(xì)胞的抑制作用隨時(shí)間和濃度的增加而增強(qiáng)，MTT結(jié)果示當(dāng)濃度為 800 感/ml，作用 48 h時(shí)抑制率為(51.30 ± . 1 0)%。結(jié)論海藻多糖體外可抑制HL- 6 0細(xì)胞增殖，提示其在抗腫瘤方面有一定的開發(fā)應(yīng)用前景?！娟P(guān)鍵詞】海藻多糖； HL-60細(xì)胞；增殖【 Abstract】 Objecti

2、veTo explore the effect of seaweedpolyaccharide on the proliferation in the HL-60 cell line.MethodThe MTT,clone forming approaches and cell morphology were adopted.ResultsSeaweedpolyaccharide can inhibit the proliferation of HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner in a certain range of dose

3、 (0 80 0g/ml) . After being treated with the polysaccharide (800 g/ijml) for 48 h,the in hibited rate is (51.30±3 . 10)%.C on slusi on The seaweed polysaccharide can in hibit the HL-60 cell proliferation,suggesting it can be used as an antileukemia drug. 【Key words】 seaweed polysaccharide,HL-60

4、 cell,proliferation 多糖在細(xì)胞的生命活動(dòng)中起著重要作用，它參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分 化、衰老和死亡過程。我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)常用馬尾藻等治療乳腺癌與子 宮癌,國(guó)外也開展了使用海藻多糖進(jìn)行腫瘤防治的研究。本文采用由 湛江產(chǎn)馬尾藻中提取的海藻多糖研究其對(duì)HL- 6 0細(xì)胞增殖的影響。 1 材料與方法 1.1試劑與儀器海藻多糖 (廣東醫(yī)學(xué)院劉秋 英碩士惠贈(zèng)),RPMI- 1 6 4 0培養(yǎng)基(Gibco Co,USA )，四甲基偶 氮唑(MTT , Sigma 公司),Hoechst 33258(Sigma 公司)，碘化丙啶(PI, Sigma公司),4000 mPa.s甲基纖維素(Sigm

5、a公司)。儀 器：OLYMPUS IMT- I型倒置相差顯微鏡(Japan),丹尼 酶標(biāo)儀 (Denmark), SW-CJ -IFD醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有 限公司),SHZ-LAB培養(yǎng)箱(U SA)。 1.2方法 細(xì)胞培養(yǎng)：HL- 6 0細(xì)胞株由廣東醫(yī)學(xué)院生化教研室提供。采用含 10%新生牛血清終濃度為100 U /ml青霉素、鏈霉素的 RPMI 1640 液體培養(yǎng)體系，置37C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一 次。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。 MTT 抑制實(shí)驗(yàn)：參照 文獻(xiàn)1,2，將細(xì)胞以 2X105/ml密度接種于 96孔培養(yǎng) 板中，加入不同濃度的藥物，置37 C、5% C

6、O2孵箱中分別培養(yǎng)24 h、48h、72h后，每孔加入 MTT(5 mg/ml)20卩1,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,加入 MTT裂解液(20%SDS +5 0%DMF + 30 %H 2 0） 1 0 0 G,37C、5%CO2 孵箱中孵 育8 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的 A630/A 5 7 0值，計(jì)算抑制率 （IR）。抑制率（IR） = （ 1用藥組 A值/對(duì)照組 A值）X10 0 %。 半固體培養(yǎng)：培養(yǎng)體系為2X10 2/ml細(xì)胞，RPMI1640 培養(yǎng)基, 30%新生牛血清,不同濃度的藥物,0.9%甲基纖維素，分別種入24孔板中，每孔1.5 ml,重復(fù)3孑L,置37C、 5%CO2孵箱中培養(yǎng)，于

7、第 7天計(jì)算細(xì)胞集落數(shù)，以每團(tuán)大于 50 個(gè)細(xì)胞為一個(gè)集落。形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)體系為2X10 5/ml細(xì)胞，RPMI 1640培養(yǎng)基，馬尾藻多糖終濃度分別為0（對(duì)照）、300、5 0 0、800 ag/ml，加入 24 孔板中，每孔 2 m l,重復(fù)3孑L,分別在15 d,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變 化，并拍照。統(tǒng)計(jì)處理：本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料用x 士s表示，使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，采用SNK-q檢驗(yàn)。 2結(jié)果2.1 MTT 結(jié)果以不同濃度（0、50、100、200、400、 8 0 0 ag/ml ）的海藻多糖作用于 HL- 6 0細(xì)胞24h>4 8h和72 h, MTT法檢

8、測(cè)其對(duì)HL- 6 0細(xì)胞增殖的影響，見表1。 隨著海藻多糖濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),抑制率逐漸增加。當(dāng) 濃度為800 ag/ml，作用 48 h時(shí)抑制率為（51. 3 0 士3 . 1 0）%，與對(duì)照組相比差異有顯著性（PV0 .01）。 表1海藻多 糖對(duì)HL- 6 0細(xì)胞增殖的抑制作用（略）2.2集落培養(yǎng)結(jié)果海藻多糖對(duì)HL- 6 0細(xì)胞集落形成有明顯的抑制作用，在1008 00ag/ml濃度范圍內(nèi)，集落逐漸減少；濃度為 800 ag/ml時(shí)未見有細(xì)胞存活，僅見殘余細(xì)胞碎片；與對(duì)照組相比，差異有 顯著性（PV0 .0 1 ），結(jié)果見表2。表2海藻多糖對(duì)HL- 6 0細(xì)胞 集落形成的影響（x

9、士s,n = 3 ）濃度（ag/ml ）集落數(shù) 0219.67 士 6 .4 9 50 2 0 6 . 3 3 士3 .7 2 1 0 0 1 6 4 . 8 9 士7 .93 2001 0 6 . 8 9 士3 .9840026 .4 4 士1 . 58 8 0 0 0 . 0 0 士0 .0 0 與對(duì)照組相比 PV0 .05, PV0 .01;F=112 1.75。2. 3海藻多糖對(duì) HL- 60細(xì)胞形態(tài)的影響處理后24h,各濃度組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組未見明顯差異，72 h各處理組可見部分細(xì)胞核變大，約為普通細(xì)胞的 12倍，以300 a /ml組 較多見。隨著處理時(shí)間的增加,較大細(xì)胞逐漸增多,

10、少數(shù)體積達(dá)到 普通細(xì)胞的 34倍,相差顯微境下可見部分較大細(xì)胞先是核膜邊 緣出現(xiàn)多個(gè)突起后細(xì)胞核逐漸碎裂、分散,最終細(xì)胞破碎死亡。濃 度越高,出現(xiàn)破碎死亡的細(xì)胞越多。3討論 白血病是人群發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一,化療是重要的治療手段,但其副作用大是 其幾乎不可克服的缺點(diǎn)。在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中,中草藥在抗腫瘤中的應(yīng)用 源遠(yuǎn)流長(zhǎng),如馬尾藻等治療乳腺癌和子宮癌?，F(xiàn)代研究證明近 100 種中藥多糖有不同程度的抗腫瘤作用。我們的研究結(jié)果表明，海藻 多糖對(duì)HL- 6 0細(xì)胞增殖呈明顯抑制作用，且隨藥物濃度的提高和 作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。海藻多糖 100 臨/ml作用24 h即可 見對(duì)HL- 6 0細(xì)胞增殖的抑制，

11、當(dāng)濃度為 800 ig/ml、作用48 h時(shí)抑制率為(51.3 0 ±3 .10)%，與對(duì)照組相比差異有顯著性 (P V0 . 0 1)。其作用機(jī)制尚不清楚，已有研究表明可通過以下機(jī)制 發(fā)揮抗白血病作用：抑制 DNA合成，干擾細(xì)胞代謝。劉力生等3報(bào)道螺旋藻多糖 (PSP)對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用主要是通過對(duì) DNA合成的抑制而起作用的。并認(rèn)為 PSP的抑癌機(jī)制屬于代謝性抑 制。影響細(xì)胞酶的活性。Sogawa等4研究發(fā)現(xiàn)海藻多糖可完 全抑制白血病K562細(xì)胞DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，使白血病細(xì)胞不能 無限增殖。改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性。海藻多糖可提高S180荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞的膜流動(dòng)性，降低 H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞