姜黃素改善高血壓缺血性腦卒中神經(jīng)功能的機制及臨床研究

1、姜黃素改善高血壓缺血性腦卒中神經(jīng)功能的機制及臨床研究項目可行性報告及經(jīng)費概算一、項目可行性報告（一）立項的背景和意義。腦血管病已成為全球三大死因之一，其中又以腦卒中發(fā)病率具首。腦卒中以高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率危害人民健康，近年來隨著物質(zhì)生活水平的提高和生活方式的變化，腦卒中的發(fā)病率呈升高和年輕化趨勢。目前，我國每年新發(fā)腦卒中約200萬人，每12秒有一人發(fā)生卒中，每年死于腦卒中的約150萬人，每21秒有一人死于卒中，腦卒中以每年8.7的速率迅速增長。我國高血壓人數(shù)已達總?cè)丝诘?8.6%，絕對人數(shù)約為1.6億人，高血壓年死亡率超過100萬人。高血壓的主要轉(zhuǎn)歸是腦卒中，70%-80%腦卒中病人都

2、有高血壓或高血壓病史。高血壓是腦卒中的首要危險因素。根據(jù)衛(wèi)生部衛(wèi)生經(jīng)濟研究所報告，腦卒中給我國每年帶來的社會經(jīng)濟負擔達400億元。但目前腦卒中的治療不盡人意，尤其是腦卒中后的致殘率居高不下。腦卒中存活者僅有10%左右能完全恢復功能，而絕大多數(shù)患者留有偏癱、失語、卒中后認知和學習記憶嚴重障礙等后遺癥，對社會及家庭造成嚴重負擔。如何改善這部分患者的神經(jīng)功能，提高日常生活質(zhì)量，有著重要的社會和經(jīng)濟價值。（二）國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢。毋庸置疑，腦缺血治療的關鍵是迅速恢復腦血液灌注，防止和減輕再灌注損傷。因缺血中心區(qū)細胞嚴重缺血缺氧已造成壞死，后續(xù)治療的重點在于挽救缺血程度相對較輕的周邊組織細胞，其最

3、常發(fā)生的細胞死亡形式為凋亡。近年研究缺血性腦卒中神經(jīng)元凋亡的熱點之一是MAPK（mitogen activated protein kinase，絲裂素活化蛋白激酶）信號通路。MAPK包括胞外信號調(diào)節(jié)酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38MAPK和ERK5。JNK在缺血性神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用，JNK激活是細胞凋亡的必要條件1。各種因素導致JNK激活后可使激活的JNK核轉(zhuǎn)位，使c-jun磷酸化并與Fos結(jié)合成為AP-1轉(zhuǎn)錄因子，啟動凋亡基因（如AIF、細胞死亡蛋白DP5等）的轉(zhuǎn)錄表達，DP5等致使胞漿Bax轉(zhuǎn)位于線粒體外膜上，促進細胞凋亡2。激活的JNK也可聚集到線粒體外膜上

4、，催化Bcl-2家族抗凋亡蛋白磷酸化而失去活性，從而促進細胞凋亡。抗氧化劑可抑制JNK的激活及減輕凋亡的發(fā)生3。JNK有三個亞型（JNK1、JNK2、JNK3），通過基因敲除研究發(fā)現(xiàn)，JNK三個亞型均參與缺血后細胞凋亡信號，但JNK1、JNK2主要在腦發(fā)育中發(fā)揮作用，而JNK3在缺血后凋亡信號中發(fā)揮主導作用4 。JNK-PSD95-MLK3信號轉(zhuǎn)導通路在正常血壓大鼠腦缺血再灌注損傷中起重要作用3。除上述機制外外，炎癥反應是腦缺血再灌注損傷的重要機制之一。腦缺血再灌注損傷級聯(lián)反應涉及能量代謝障礙、細胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、梗塞周圍去極化、血腦屏障破壞、促炎細胞因子和粘附分子的高表達、細胞

5、內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激活等。其中腦缺血再灌注可導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)TNF、白介素1（IL-1）、白介素6（IL-6）、粘附因子等炎癥介質(zhì)和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）等神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控因子表達增多，并能激活下丘腦-垂體-靶腺軸5,6。下丘腦垂體腎上腺軸（HPA）是與腦缺血再灌注病理過程關系最為密切的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)軸，急性缺血性卒中患者常伴有促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、糖皮質(zhì)激素(GCs)水平增高，其增高程度與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害嚴重程度一致。因此，損傷的病理過程與機體復雜的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是免疫系統(tǒng)和應激系統(tǒng)關系密切。姜黃素是從姜黃根莖中提取的酚性色素，廣泛應用于食品添加劑和著色

6、劑中。具有抗炎、抗氧化損傷、抗應激等廣泛的藥理活性。本課題組近年發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制JNK的磷酸化及表達，顯著減輕鼠前腦缺血再灌注損傷等（我們已發(fā)表二十余篇系列文章，請見工作基礎）。考慮到基礎研究的給藥方式均為缺血前給藥，但在臨床腦卒中患者往往是急性發(fā)病，且病人常伴有高血壓疾病，那么，在高血壓情況下，姜黃素復灌后給予是否仍能減輕缺血再灌注損傷？確實，很多基礎研究有很好療效的藥物，到臨床真正應用卻效果甚微。原因何在？除有些藥物難以透過血腦屏障外，是否與基礎研究在正常血壓情況下進行，而事實情況卻不盡如此有關？是否在高血壓和正常血壓情況下，因信號轉(zhuǎn)導通路物質(zhì)表達改變而導致藥物療效有較大差別？長期高血壓會

7、導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生顯著改變，如：高血壓大鼠腦內(nèi)基因和相關物質(zhì)的表達9明顯不同于正常血壓大鼠；內(nèi)向整流鉀通道在高血壓時功能活動減弱，神經(jīng)元短暫電壓依賴性鉀電流明顯減少10；13周齡自發(fā)性高血壓大鼠與同齡正常血壓大鼠的室旁核神經(jīng)元基礎激活頻率明顯不同 11。長期高血壓后中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導通路的改變還沒有引起人們足夠的重視，報道極少。我們和他人的實驗結(jié)果均表明自發(fā)性高血壓大鼠腦缺血后損傷明顯重于正常血壓大鼠，長期高血壓腦組織處于低氧狀態(tài)，缺氧易損性增加，皮層脂質(zhì)過氧化反應增強、腦出血后梗死面積明顯增大9；缺血后代謝失衡遠高于WKY大鼠，AMPA受體亞單位Glu1、Glu2和WKY（Wi

8、star-Kyoto）大鼠有顯著差異。高血壓大鼠通過抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子保護作用及某些遺傳性因素，加重腦缺血損傷。為此，為符合臨床實際情況，我們采用缺血后給藥的方式。發(fā)現(xiàn)缺血復灌后自發(fā)性高血壓大鼠學習和記憶能力下降，海馬神經(jīng)元凋亡和p-JNK 、JNK3表達增加7。缺血后30min腹腔注射姜黃素100mg/kg能顯著改善學習和記憶能力，減少再灌注后SHR海馬CA1區(qū)TUNEL染色陽性神經(jīng)元，明顯抑制JNK3的表達，但PSD95蛋白總量和MLK3變化不大8。提示：是否JNK-PSD95-MLK3信號轉(zhuǎn)導通路在高血壓腦缺血損傷中不起主要作用，而姜黃素的抗炎和抗氧化作用在起著主要作用？那么，基礎研

9、究表明對缺血后神經(jīng)元有很好保護作用的姜黃素對高血壓腦卒中神經(jīng)功能是否仍有保護作用？其確切機制是否與姜黃素抗炎及抗應激有關？盡管生物利用率較低，姜黃素已被用于治療各種疾病，包括癌癥、心血管疾病、糖尿病、關節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病以及克羅恩病12 。在美國，姜黃素已作為一種保健用品開始為市民所接受。如在臨床高血壓病人腦卒中后盡早在治療中加用姜黃素對神經(jīng)功能是否仍然具有保護作用？C-反應蛋白（CRP） 是反映急慢性炎癥的穩(wěn)定的炎性標記物，CRP 水平是死亡的一項獨立預測指標，臨床血清CRP濃度的增高是腦梗死重要的危險因素，極高濃度的血清CRP 預示著更嚴重的炎癥反應13。而基質(zhì)金屬蛋白9（MMP-9）的

10、異常過度活躍也可直接導致神經(jīng)元程序性死亡和腦損害。MMP-9破壞血腦屏障并形成腦水腫的同時也可誘發(fā)產(chǎn)生神經(jīng)炎性反應，在炎性反應過程中受細胞因子和原癌基因等刺激MMP-9被釋放出來，進一步加重腦組織損傷而形成惡性循環(huán)14，15。因此臨床上通過對急性缺血性腦卒中患者 MMP-9 的檢測及時發(fā)現(xiàn)病情可能的進展傾向以便及早預防和治療。MMP-9及CRP是臨床反映炎癥水平及預后的指標。鑒于以上設想，本研究擬分成兩部分：（1）動物實驗：采用整體大鼠前腦缺血再灌注損傷模型，應用行為學、分子生物學、免疫組織化學等技術，觀察姜黃素對正常大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠缺血再灌注后海馬形態(tài)學、CA1區(qū)平均椎體細胞密度、炎癥

11、介質(zhì)以及血清皮質(zhì)酮水平等的影響，探索姜黃素能否抑制自發(fā)性高血壓大鼠腦缺血后炎癥反應和應激反應？（2）臨床研究：收集高血壓腦卒中病人，在術后盡早在常規(guī)治療情況下加用姜黃素，一周內(nèi)檢測血液中MMP-9和CRP濃度，隨訪3-6個月，觀察姜黃素可否提高卒中后神經(jīng)功能的恢復。為病人康復治療開辟新的領域。參考文獻：1、Tian H, Zhang QG, et al. Activation of c-Jun NH2-terminal kinase 3 is mediated by the GluR6-IPSD-95-MLK3 signaling module following cerebral ische

12、mia in rat Hippocampus. Brain Res, 2005, 1061:57-66.2、Guan QH, Pei DS, Xu TL et al. Brain ischemia/reperfusion-induced expression of DP5 and its interaction with Bcl-2, thus freeing Bax from Bcl-2/Bax dimmers are mediated by c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathway. Neurosci Lett,2006,393:226-230.3、Zha

13、ng QG, Tian H, Li HC, et al. Antioxidant N-acetylcysteine inhibits the activation of JNK3 mediated by the GluR6PSD95MLK3 signaling module during cerebral ischemia in rat hippocampus. Neurosci lett, 2006, 408:159-164.4、Yi Zhao，Thomas HerdegenCerebral ischemia provokes a profound exchange of activated

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15、n Brain Research, 2007, 163:339-351.7、*. 腦缺血再灌注對自發(fā)性高血壓大鼠認知功能及海馬神經(jīng)元凋亡的影響。中華麻醉學雜志，2008，28（11）：1029-1032.8、*. Curcumin Perotects Against Ischemia/Reperfusion-Induced Neuronal Apoptosis through Inhibiting JNK3 in SHR. American Society of Anesthesiology meeting, 2010：A614.9、Zhu ZM, Zhao B, Wang XN, et al

16、. Differentially expressed genes in hypertensive rats developing cerebral ischemia. Life Science, 2004, 74:1899-1909.10、Lee TH, Yang JT, Kato H, et al. Hypertension downregulates the expression of brain-derived neurotrophic factor in the ischemia-vulnerable hippocampal CA1 and cortical areas after c

17、arotic artery occlusion. Brain Research, 2006,1116:31-38.11、Belugin S, Mifflin S. Transient voltage-dependent potassium currents are reduced in NTS neurons isolated from renal wrap hypertensive rats. J Neurophysiol, 2005, 94(6):3849-59.12、Goel A, Kunnumakkara AB, Aggarwal BBCurcumin as “Curecumin”:

18、from kitchen to clinic. Biochem Pharmacol, 2008,75(4):787809.13、Kaptoge S, Angelantonio ED et al. C-reactive protein concentration and risk of coronary heart disease, stroke, and mortality: an individual participant meta-analysis. Lancet, 2010; 375: 132-40.14、Kurzepa J, Bielewicz J, Grabarska A, te

19、al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to the increase of tau protein in serum during acute ischemic stroke. Journal of Clinical Neuroscience,2010, 17:997999.15、Cunningham LA, Wetezl M, Rosenberg GA. Multiple roles for MMPs and TMPs in cerebral ischemia. Glia, 2005; 50(4):329-339.（三）項目主要研究開發(fā)內(nèi)容、技

20、術關鍵及主要創(chuàng)新點。3.1 項目研究內(nèi)容（1）采用整體大鼠前腦缺血再灌注損傷模型，應用行為學、分子生物學、免疫組織化學等技術，觀察姜黃素對正常大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠IR后海馬形態(tài)學、CA1區(qū)平均椎體細胞密度、TNF、白介素1等炎癥介質(zhì)以及血清皮質(zhì)酮水平等的影響，闡明姜黃素改善自發(fā)性高血壓大鼠腦缺血神經(jīng)功能的確切機制。（2）收集高血壓腦卒中病人60-80例，隨機分為兩組，在術后2-3天開始，在常規(guī)治療情況下加用姜黃素或安慰劑，一周內(nèi)檢測血液中MMP-9和CRP濃度，隨訪3-6個月，采用美國國立衛(wèi)生研究院中風神經(jīng)功能缺損評分（NIHSS）、格拉斯哥昏迷評分（GCS）、格拉斯哥治療結(jié)果評分(GOS)

21、、Barthel指數(shù)（BI）、修正的RANKIN標準（mRS）、中風專門生活質(zhì)量量表（SS-QOL）、梗死灶體積測量（MRI）等方法，觀察姜黃素可否提高病人卒中后神經(jīng)功能的恢復。3.2 技術關鍵本實驗擬采用的研究方法均為常用方法，本課題組均已掌握，WKY和自發(fā)性高血壓大鼠可購自上海實驗動物中心。本研究最困難的是臨床病人的收集，但本單位神經(jīng)內(nèi)科中西醫(yī)結(jié)合腦血管病治療方向為省重點學科，每年收治腦卒中病人200例，可為本項目提供充足的病人。3.3 主要創(chuàng)新點在以往系列研究的基礎上，通過觀察姜黃素對自發(fā)性高血壓大鼠腦缺血再灌注后炎癥介質(zhì)及皮質(zhì)醇等指標，明確炎癥反應和應激反應在姜黃素減輕高血壓大鼠腦缺血

22、再灌注損傷的機制。并通過基礎實驗和臨床研究相結(jié)合，選用高血壓腦卒中病人和卒中后給藥方式，通過MMP9和CRP這二個反映炎癥的指標及系列神經(jīng)功能評分指標，明確姜黃素可改善高血壓腦卒中神經(jīng)功能的恢復，明確腦卒中早期姜黃素治療的有效性及安全性，為今后腦卒中早期治療提供一種新的手段，為早期康復治療開辟新的領域，為傳統(tǒng)中藥姜黃素進一步應用于心腦缺血性疾病的臨床治療提供實驗基礎、理論依據(jù)及新的藥物作用靶點。（四）項目預期目標1、闡明炎癥反應和應激反應在姜黃素改善缺血性腦卒中神經(jīng)功能中的確切機制。2、明確腦卒中早期姜黃素治療的有效性及安全性。3、在國家級以上核心期刊上發(fā)表相關論文3-4篇，其中SCI論文1-

23、2篇。4、培養(yǎng)碩士研究生4名（五）項目實施方案、技術路線、組織方式與課題分解。5.1 項目實施方案【研究方法一】：動物實驗部分（1）確認高血壓動物：自發(fā)性高血壓大鼠均在實驗前采用無創(chuàng)尾動脈測壓法測壓，收縮壓140mm Hg者入選。（2）前腦缺血再灌注損傷模型的制備：隨后按Pulsinelli 等四血管阻斷法進行腦缺血模型制作。手術過程中持續(xù)進行肛溫監(jiān)測，并維持大鼠體溫恒定。（3）模型動物入選標準：符合以下條件的大鼠入選缺血再灌流組：A.動脈夾閉60 s內(nèi)，大鼠翻正反射消失；B.雙側(cè)瞳孔持續(xù)開大，輕觸條件下角膜反射消失；C.肛溫穩(wěn)定在36. 037. 0范圍內(nèi)。（4）實驗分組：分為正常血壓WKY

24、大鼠對照組、正常血壓WKY大鼠缺血組、正常血壓WKY大鼠假手術組、自發(fā)性高血壓大鼠假手術組、自發(fā)性高血壓大鼠對照組、自發(fā)性高血壓大鼠缺血組、自發(fā)性高血壓大鼠溶劑對照組、自發(fā)性高血壓大鼠100 mg/Kg、200 mg/Kg姜黃素組復灌后即刻給予組、30分鐘給予組、60分鐘給予組。上述3實驗組按再灌注時間再分為再灌注0.5h、3h、6h、1d、3d、7d共6個時間點的六個亞組，第7 天測定行為學后將動物處死。標本需要兩批，一批采用甲醛固定，標本用于形態(tài)學、免疫組化等實驗，另一批實驗結(jié)束取活體標本，用于分子生物學指標測定。（5）采用下述行為學方法測定大鼠學習和認知能力：采用跳臺實驗進行觀察。將大鼠

25、放入箱中訓練5 min ，記錄首次找到安全區(qū)所需的時間(反應時間) 和5 min 內(nèi)受到的電擊次數(shù)(錯誤次數(shù))，作為學習成績。1 d后重復上述實驗，記錄第1次跳下安全區(qū)的時間（潛伏期）和錯誤次數(shù)，作為記憶成績。（6） 免疫組化和免疫熒光標記：標記膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元TNF、白介素-1、白介素-6、白介素-8、ICAM-1等炎癥介質(zhì)的表達及分布情況。（7）分子生物學實驗樣品制備：大鼠斷頭處死，迅速開顱并取出整個大腦，在冰凍的生理鹽水中冷卻1015s后剖開兩半球，在冰面上取出兩側(cè)完整海馬，置于液氮中凍存。視免疫組化實驗結(jié)果取材。如膠質(zhì)細胞表達不同于神經(jīng)元，則整個海馬組織作為標本，提取細胞不同部分測定相

26、應指標，如果物質(zhì)表達有重疊，則需分離海馬的不同部位做標本，提取細胞不同部分測定相應指標。（8）免疫沉淀和免疫印跡方法： 此法為本實驗室常用方法，用此方法測定蛋白表達水平。（9）采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定海馬組織白介素及皮質(zhì)醇：方法參照試劑盒。（10）采用DNA原位末端標記法（TUNEL）檢測細胞凋亡：使用德國寶靈曼公司原位細胞凋亡檢測藥盒。（11）統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用組間比較的t檢驗和方差分析等方法進行統(tǒng)計學處理，按I型誤差=0.05，分析統(tǒng)計學意義?！狙芯糠椒ǘ浚号R床研究部分通過對急性期前循環(huán)腦梗死患者加用姜黃素治療，并進行多時點隨訪評估，觀察急性期姜黃素應用對

27、腦梗死患者病死率、梗死灶形態(tài)、神經(jīng)功能缺損、殘障和生存質(zhì)量的影響，并分析藥物應用安全性。整個試驗過程包括14天治療階段和其后6個月的隨訪階段。受試者納入研究后接受初始評估和檢測，住院14天以上，期間受試者在發(fā)病24h內(nèi)開始接受姜黃素或安慰劑對照治療，連續(xù)治療14天，兩組受試者均接受常規(guī)CT、MR、血指標（常規(guī)指標及MMP9、CRP）等檢查并給予必要的急性腦梗死的一般治療措施如抗血小板、控制血壓、顱壓、降脂、平衡水電解質(zhì)等。分別于發(fā)生急性腦梗死后第14、30、90、180天進行隨訪（臨床量表和必要的檢查）。評估時點共5次，分別為入組評估以及在發(fā)病后第14天，及第30、60、90、180天進行療效

28、和安全性評價，考慮節(jié)假日工作安排分別將窗口設置在治療后第14天、30±3天、90±7天和180±7天。研究對象：入選標準 ：（1）首發(fā)性急性前循環(huán)腦梗死，包括半年前有中風史，但癥狀已完全緩解者；4 NIHSS 20（2）18歲的住院病人，性別不限；（3）起病24小時以內(nèi)；（4）腦CT 排除出血可能；（5）簽署知情同意書。排除標準：符合以下各條之一者，不能入組：（1）NIHSS3；NIHSS21（2）心功能不全，慢性肝病(A/G倒置)，ALT升高(大于正常值1.5倍)，血肌酐升高(大于正常值1.5倍)；（3）過敏體質(zhì)，對多種藥物有過敏史者；（4）妊娠期或哺乳期婦女。

29、試驗藥物：試驗藥：姜黃素（美國Swanson公司生產(chǎn)，此為美國生產(chǎn)保健品的公司）。對照藥物采用安慰劑。兩組伴隨用藥的規(guī)定:伴發(fā)病的治療不限制，如降血糖、控制感染、預防深靜脈血栓形成等，但是不得使用其他神經(jīng)細胞營養(yǎng)劑,如神經(jīng)節(jié)苷酯、銀杏葉制劑、依達拉奉、尼莫地平等。兩組可根據(jù)臨床需要使用甘露醇、速尿、甘油果糖、血漿、人血白蛋白等。主要評估指標：（1）美國國立衛(wèi)生研究院中風神經(jīng)功能缺損評分（NIHSS）（2）格拉斯哥昏迷評分（GCS）（3）格拉斯哥治療結(jié)果評分(GOS)（4）Barthel指數(shù)（BI）（5）修正的RANKIN標準（mRS）（6）中風專門生活質(zhì)量量表（SS-QOL）（7）梗死灶體積測

30、量（MRI）安全性評估：受試者主動提供或經(jīng)非誘導性提問后得出的不良事件/反應，以及臨床和實驗室檢查的結(jié)果。如治療期間出現(xiàn)的再發(fā)卒中、各種出血等。除常規(guī)檢測方法，采受試者空腹靜脈血 5 mL 3 mL送臨床中心實驗室，靜置1 2 h后離心3 000 rmin 離心10 min 后吸取血清放入20冰箱，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA 分批測定MMP-9 濃度及超敏 C反應蛋白 hs-CRP 濃度。數(shù)據(jù)分析：進行關于療效及安全性方面的統(tǒng)計學分析；以及療效評價指標的探索分析。前腦缺血再灌注損傷模型WKY、SHR大鼠對照組缺血組假手術組組不同時間點處死，行為學測定視實驗結(jié)果制備樣品灌注甲醛、制

31、備組織塊、切片免疫沉淀、免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附法蛋白激酶活性測定形態(tài)學檢查、免疫組化、免疫熒光TUNEL檢測凋亡細胞復灌后不同時間給予姜黃素、溶劑結(jié)合行為學實驗結(jié)果分析、資料整理分析結(jié)果后補充相應工具藥組視實驗結(jié)果補充相應工具藥結(jié)果分析、資料整理論文撰寫 總結(jié)5.2 動物實驗技術路線： 5.3 組織方式與課題分解項目采取總體設計與實施由申請人全面負責、課題組成員分工合作的組織方式。項目負責人根據(jù)設計的課題，對課題組成員進行有關實施方案及臨床檢測等方法的培訓，重點做好病例選擇、資料登記工作，做到互相配合、互相協(xié)作。同時定期進行階段匯總及結(jié)果分析。課題分解：本課題分解為二個部分：1、臨床病例選擇與

32、藥物治療：由第2、4、5責任人負責。2、動物實驗部分由第1、3、6、7、8責任人負責。3、相關資料收集、整理、統(tǒng)計分析及論文撰寫：第1、2責任人負責。（六）計劃進度安排。2011.1至2011.2：查找相關文獻，了解相關領域的最新動態(tài)進展，制定具體實施的方案，對課題組成員進行培訓，為課題開展完善各項準備工作。2011.3至2011.9：動物實驗部分購買動物、訂購試劑，制備高血壓大鼠腦缺血模型，完成行為學及部分免疫組化實驗及凋亡檢測；臨床研究部分收集病例，按預定計劃在常規(guī)治療基礎上，分別給與姜黃素及安慰劑，一周內(nèi)檢查相應常規(guī)指標及MMP-9及CRP，隨訪3-6月，完成入選病人各項行為學檢查。20

33、11.10至2011.12：回顧前階段的工作，并進行統(tǒng)計學分析與查漏補缺和階段性總結(jié)。2012.1至2012.6：制備另一批動物，完成部分分子生物學實驗，進行酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測白介素及皮質(zhì)醇等。送審部分論文。繼續(xù)收集病人，進行臨床研究。2012.7至2012.12：完成分子生物學實驗，完成部分論文的撰寫。繼續(xù)收集病人，進行臨床研究。完成部分論文的撰寫。 對所有結(jié)果進行初步整理、分析，針對實驗結(jié)果進行補充實驗。2013.7-2013.12進行總結(jié)及統(tǒng)計學分析,撰寫論文與驗收鑒定資料，組織驗收。（七）現(xiàn)有工作基礎和條件。7.1工作基礎申請人工作基礎：（1）申請者具有較深入的研究基礎和資料積累。申

34、請者自1999在美國學習成年大鼠海馬腦片培養(yǎng)技術，并成功用此技術作了一定的實驗，對腦缺血性損傷產(chǎn)生了濃厚的興趣。近五年作為課題負責人已獲得國家自然科學基金課題二項、省課題四項，以第一參加者獲得省課題三項，其中四項課題有關腦缺血性損傷機制研究，以第二參加者參與國家自然科學基金課題一項，以上課題除在研省自然及國家自然科學基金各一項外（此兩項課題均為姜黃素對疼痛的影響課題），其余均已完成。有關缺血再灌注損傷論文已獲省科技進步三等獎二項、省衛(wèi)生廳醫(yī)藥創(chuàng)新一等獎一項、二等獎一項。關于此領域已積累了很好的工作基礎。（2）申請者已掌握腦缺血再灌注損傷模型，近五年一直指導研究生從事腦缺血方面的研究。目前仍有3

35、名碩士生正從事此領域的研究。學科每年招收研究生二十余名，感興趣的研究生均可加入本項目的研究。（3）本院科研中心具備全套的分子生物學常用設備及細胞及腦片培養(yǎng)條件，已建立了一系列分子生物學研究技術，在技術上沒有任何問題。麻醉學科有學科獨立的實驗室，實驗所需儀器設備均已具備。（4）申請人近年發(fā)表和國際會議錄用的有關腦缺血論文如下：1.The Effect of Pre-ischemic or Post-ischemic Administration of Lidocaine or Thiopental on Ischemic Injury to Rat Hippocampal Slice Cultu

36、res. Anesthesia and Analgesia，2005，101（4）：1163-11692.姜黃素對腦缺血再灌注損傷的保護效應.國外醫(yī)學.麻醉與復蘇分冊，2005,26（3）：157-1603.SB202190減輕沙土鼠海馬CA1區(qū)腦缺血再灌注損傷的作用與磷酸化Caspase23含量變化的關系.中國藥理學通報，2005，21（9）：1150-11514.缺血預處理對腦缺血再灌注損傷沙土鼠海馬細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和c-jun氨基末端激酶表達的影響.中華麻醉學雜志，2005，25（1）：30-335.亞低溫對沙土鼠前腦缺血再灌注海馬神經(jīng)元凋亡及p38活性的影響.中國藥理學通報，2005

37、，21（8）：970-9736.缺血預處理對腦缺血再灌注損傷沙土鼠海馬細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和c-jun氨基末端激酶表達的影響，中華麻醉學雜志，2005，25（1）：30-337.MAPK家族在沙土鼠前腦缺血再灌注期間海馬神經(jīng)元表達的動態(tài)變化，XX醫(yī)學院學報，2006，36（5）：407-4108. ERK和JNK通路在沙土鼠腦缺血預處理中的表達及作用.中國藥理學通報，2006， 22 (3) : 337-409. 姜黃素對沙土鼠Bcl-2、Bax在海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)表達的影響及意義.XX交通大學學報，2006，37（12）：548-55110.姜黃素對沙土鼠腦缺血/再灌注損傷的海馬CA1區(qū)細

38、胞凋亡和即早基因c-fos、c-jun、NF-B表達變化的關系 中國應用生理學雜志，2007，23（2）：184-18711.姜黃素減輕沙土鼠海馬CA1區(qū)腦缺血再灌注損傷與熱休克蛋白表達變化的關系.XX醫(yī)學院學報，2007，37（4）：317-32012.姜黃素對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用.山東醫(yī)藥，2007 Vol.47 No.16 ：42-43 13.JNK通路在缺血預處理誘導海馬神經(jīng)元保護中的作用.中國藥理學通報，2007，23（3）3465014.NMDA受體在腦缺血中的作用和機制的研究進展. 國際麻醉學與復蘇雜志，2007，28（1）：88-9115.p38

39、MAPK在沙土鼠前腦缺血再灌注損傷及缺血預處理中的作用，中華麻醉學雜志，2007，27（5）：467-47116.亞低溫對沙土鼠前腦缺血/再灌注海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡及Bcl-2、Caspase-3表達的影響.中國藥理學通報，2007，23（1）： 77-7817.MAPK家族在沙土鼠前腦缺血再灌注期間海馬神經(jīng)元表達的動態(tài)變化.XX醫(yī)學院學報，2006，36（5）：407-41018紅.姜黃素抑制缺血/再灌注大鼠海馬神經(jīng)元c-jun的磷酸化和Fas L的表達. XX醫(yī)學院學報，2007，27（10）：643-64519.ERK通路在腦缺血及缺血預處理沙土鼠海馬神經(jīng)元中的作用。中國應用

40、生理學雜志,2008 ;24 (2)：237-24220.姜黃素對缺血/再灌注大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡及NR2A、NR2B表達的影響.中國藥理學通報. 2008 ; 24 (10) : 1314131821.腦缺血再灌注對自發(fā)性高血壓大鼠認知功能及海馬神經(jīng)元凋亡的影響。中華麻醉學雜志，2008，28（11）：1029-103222.Curcumin Perotects Against Ischemia/Reperfusion-Induced Neuronal Apoptosis through Inhibiting JNK3 in SHR. American Society of Anesthes

41、iology meeting, 2010：A61423.Effects of NMDA and AMPA receptors agonists or antagonists on ntinociception of propofol. ASA annual meeting ，October，22-26，200524.Effect of curcumin on serum cortisol concentration and 11HSD1 expression in stressful rats. Anesthesiology, 2009,111: A11725.Effect of curcum

42、ine on caspase-12 during hippocampal ischemia-reperfusion injury in SHR. Anesthesiology, 2009,111: A407項目第二負責人介紹：碩士生導師，教授，主任醫(yī)師。1991年畢業(yè)于浙江大學臨床醫(yī)學系。1999年曾在北京醫(yī)科大學第一臨床學院進修神經(jīng)免疫學專業(yè)。2003年曾在上海第二醫(yī)科大學生物醫(yī)學研究所短期進修。2004年1月至2005年4月在美國Baylor醫(yī)學院神經(jīng)科學習。2007年始任主任醫(yī)師。2008年晉升教授。近年主持的課題包括國家自然科學基金項目、浙江省自然科學基金、浙江省科技廳錢江人才項目、浙

43、江省衛(wèi)生廳、浙江省教育廳項目各一項。近年發(fā)表的部分論文：1、Neuroprotection by iron chelator against proteasome inhibitor-induced nigral degeneration. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Jul 29;333(2):544-9. 2、G309D and W437OPA PINK1 mutations in Caucasian Parkinson's disease patients. Acta Neurol Scand2005, 111: 351-352 3、Gene

44、tic analysis of parkin co-regulated gene (PACRG) in patients withearly-onset parkinsonism. Neuroscience Letters 2005, 382: 297299 4、Projections of diencephalic dopamine neurons into the spinal cord in mice. Exp Brain Res. 2006 Jan;168(1-2):152-156. 5、The experimental investigation of homocysteine-in

45、duced apoptosis of endothelial cell and its antagonism by folic acid. Journal of The Neurological Sciences 238: S399-s3996、Locomotion is increased in a11-lesioned mice with iron deprivation: a possible animal model for restless legs syndrome. J Neuropathol Exp Neurol. 2007 May; 66(5):383-8.7、Decreas

46、ed NURR1 gene expression in patients with Parkinson's disease. J Neurol Sci. 2008 Oct 15;273(1-2):29-33.7.2工作條件承擔本項目研究的單位三甲醫(yī)院，具有很好的實驗設備和條件，醫(yī)學院所有儀器均對全院開放、全院一盤棋。醫(yī)院科研中心5.0萬元以上的儀器20余臺（包括日立超速離心機、美國ELT超低溫冰箱，微量天平、電熱恒溫干燥箱、多功能紫外透射儀、PCR擴增儀、酶標儀、電泳儀、CO2培養(yǎng)箱、雙目顯微鏡、萊卡倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、超靜工作臺、電泳圖像分析儀、紫外分光光度計、振動切片機、冰凍切片機等）。另有配套實驗室（普通實驗室、稱量制劑室、分子生物學實驗室、動物實驗室、細胞培養(yǎng)室、離心室、低溫冰箱室、熒光計算機室等）及各種配套小型儀器。本學科另有單獨實驗室，因此，完成本項目具有良好的實驗條件，不需購買大型儀器。本學科為浙江省醫(yī)學重點學科、浙江省重中之重學科。本學科有一批有一定科研基礎的博士、碩士，在科研人員上有充分的保證。學科近年來在科研方面積累了較好的基礎：近三年獲國家自然科學基金課題7項，近五年省部級課題10項，廳局級重點課題5項，廳局級課題48項。近三年發(fā)表SCI論文11篇，國際會議錄