2015年初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證

1、初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證方案產(chǎn)品名稱：一次性包皮環(huán)切縫合器編制：日期：審核：日期：批準(zhǔn)：日期：江西狼與醫(yī)療器械股份限有限公司目錄初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證方案1。概述2。驗(yàn)證目得3.職責(zé)與驗(yàn)證申請(qǐng)4.驗(yàn)證依據(jù)5.驗(yàn)證計(jì)劃6。驗(yàn)證內(nèi)容初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證方案1、概述：初始污染菌得數(shù)量可以反映出車間環(huán)境衛(wèi)生得清潔度，與產(chǎn)品滅菌工藝、成品熱原及內(nèi)毒素有直接關(guān)系，故而要對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)其有效性及檢測(cè)準(zhǔn)確性從而優(yōu)化產(chǎn)品滅菌工藝及控制產(chǎn)品熱原及內(nèi)毒素，確保產(chǎn)品得安全性.2、目得：？通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證檢測(cè)方法得適用性及計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基得適用性。3、職責(zé)與驗(yàn)證申請(qǐng)：3、1質(zhì)量管理部提供檢測(cè)項(xiàng)目方案、接收標(biāo)準(zhǔn)、評(píng)價(jià)

2、等級(jí)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。3、2生產(chǎn)技術(shù)部負(fù)責(zé)按驗(yàn)證方案生產(chǎn)相關(guān)樣品初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證申請(qǐng)表驗(yàn)證組姓名職務(wù)單位黃燕組長(zhǎng)質(zhì)量管理部經(jīng)理江西狼與醫(yī)療器械股份有限公司龍阜玄組員化驗(yàn)員蘇俊組員化驗(yàn)員胡梓鵬組員化驗(yàn)員批準(zhǔn)經(jīng)研究：同意以上成員組成驗(yàn)證小組，按照此方案對(duì)本公司得產(chǎn)品得初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證.批準(zhǔn)人：年月日4、依據(jù)：中國(guó)藥典2015版5、驗(yàn)證計(jì)劃：5、1實(shí)驗(yàn)操作人員確認(rèn)；5、2實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材得確認(rèn)；5、3產(chǎn)品取樣及方法確認(rèn)。6、驗(yàn)證內(nèi)容：6、1菌種與菌液制備6、1、1菌種試驗(yàn)用菌株得傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保藏中心獲彳#得干燥菌種為第0代),并采用適宜得菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)

3、菌株得生物學(xué)特性.6、1、2菌液制備接種金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌得培養(yǎng)物至胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基上，30?35c培養(yǎng)18?24小時(shí)；接種白色念珠菌得培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20?25c培養(yǎng)23天，上述培養(yǎng)后得新鮮培養(yǎng)物用PH7、0無菌化鈉一蛋白月S緩沖液或0、9%無菌化鈉溶液制成每1ml菌數(shù)小于100cfu(菌落形成)得菌懸液.接種黑曲霉得培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基上，20?25C培養(yǎng)5?7天，加人3?5ml0、05%(ml/ml)聚山梨酯80得pH7、0無菌化鈉一蛋白凍緩沖液或0、9%£菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫

4、。然后，采用適宜得方法吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)，用0、05%(ml/ml)聚山梨醋80得pH7、0無菌化鈉一蛋白凍緩沖液或0、9%無菌氯化鈉溶液制成每lml抱子數(shù)量小于1O0cfu得抱子懸液.菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2?8c在24h內(nèi)使用。黑曲霉抱子懸液存在2?8C,在驗(yàn)證過得貯存期內(nèi)用.6、2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查6、2、1需氧菌得計(jì)數(shù)分別取1ml得金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板。金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌在3035C,培養(yǎng)不超過3天；白色念珠菌、黑曲霉在2025C,

5、培養(yǎng)不超過5天.每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)得對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。6、2、2霉菌與酵母菌得計(jì)數(shù)分別取1ml得白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液,接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。在2025，培養(yǎng)不超過5天。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿.同時(shí)，用相應(yīng)得對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。6、2、2結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上得菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上得菌落平均數(shù)得比值應(yīng)在0、5-2范圍內(nèi),且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上得菌落一致;被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。6、2、3試驗(yàn)結(jié)果見表16、3計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證6、3、1供試液得制備：洗脫液用0、9%馬滅

6、菌生理鹽水，檢品液制備在10000級(jí)環(huán)境中進(jìn)行。6、3、2接種與稀釋按下列要求進(jìn)行供試液得接種與稀釋,制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液得體積應(yīng)不超過供試液體積得1%。為確認(rèn)供試品中得微生物能被充分檢出,首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)得供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)(1)試驗(yàn)組取上述制備好得供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過得供試液中含菌量不大于100cfu.(2)供試品對(duì)照組取制備好得供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。(3)菌液對(duì)照組取不含中與劑及滅活劑得相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn).若因供試品抗菌活性或溶解性較差得原因?qū)е聼o法選擇最

7、低稀釋級(jí)得供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí),應(yīng)采用適宜得方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步得處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)得抑制作用無法以其她方法消除,供試液可經(jīng)過中與、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)。6、3、3抗菌活性得去除或滅活供試液接種后,按下列“微生物回收"規(guī)定得方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)得值小于菌液對(duì)照組菌數(shù)值得50%,可采用下述方法消除供試品得抑菌活性.增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。加入適宜得中與劑或滅活劑。6、3、4微生物得回收按照6、2得計(jì)數(shù)培養(yǎng)基所用得試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)，回收試驗(yàn)采用平皿法與薄膜過濾法。6、3、4、1平皿法一傾注

8、法取6個(gè)直徑90mm得無菌平皿.2個(gè)分別注入照上述“試驗(yàn)組”制備得供試液1ml;2個(gè)分別注入照上述“供試品對(duì)照組”制備得供試液1ml;2個(gè)分別注入照上述“菌液對(duì)照組”制備得供試液1ml。每個(gè)平皿注入1520ml溫度不超過45C熔化得胰酪大豆陳瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。計(jì)算各試驗(yàn)組得平均菌落數(shù)。6、3、4、2平皿法試驗(yàn)結(jié)果見表26、3、4、3薄膜過濾法薄膜過濾法所采用得濾膜孔徑應(yīng)不大于0、45pm,直徑一般為50mm若采用其她直徑得濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)得調(diào)整.選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物得充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜得方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證

9、濾膜在過濾前后得完整性.供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100m1?？倹_洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上得微生物受損傷。取照上述“試驗(yàn)組”、“供試品對(duì)照組”與“菌液對(duì)照組”制備得供試液適量（一般取相當(dāng)于lg、1ml或10cm2得供試品，若供試品中所含得菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量得稀釋液中，混勻，過濾.用適量得沖洗液沖洗濾膜。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌與酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。6、3、4、4薄膜過濾法計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

10、見表3初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告報(bào)告編號(hào)：報(bào)告時(shí)間：目錄初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告1、目得2、概述3、測(cè)試方法與試驗(yàn)結(jié)果4、結(jié)論5、重新驗(yàn)證條件1、目得：參照中國(guó)藥典2015版，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證檢測(cè)方法得適用性及計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基得適用性,從而驗(yàn)證現(xiàn)在使用初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法就是否準(zhǔn)確合格。2、概述:產(chǎn)品型號(hào)為26型：批號(hào)為：3、測(cè)試方法及檢驗(yàn)結(jié)果：3、1實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：該實(shí)驗(yàn)使用儀器及器具主要有：滅菌移液管及移液槍吸嘴、無菌小泵管、培養(yǎng)皿、小型蠕動(dòng)泵、薄膜過濾器、滅菌鍋、百級(jí)工作臺(tái)、生物安全柜、電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱。設(shè)備名稱就是否校量就是否在有效期內(nèi)結(jié)論火菌鍋已校量在后效期內(nèi)符合要求百級(jí)

11、工作臺(tái)已校量在后效期內(nèi)符合要求生物安全柜已校量在后效期內(nèi)符合要求電子天平已校量在后效期內(nèi)符合要求電熱恒溫比養(yǎng)箱已校量在后效期內(nèi)符合要求霉菌培養(yǎng)箱已校量在后效期內(nèi)符合要求確認(rèn)人/日期：審核/日期：3、2使用材料及菌種：胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基、胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆陳瓊脂培對(duì)照養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉（菌種購(gòu)買單位均為微生物種質(zhì)資源庫）。3、3菌液制備：接種金色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌得培養(yǎng)物至胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基上，30?35c培養(yǎng)18?24

12、小時(shí)；接種白色念珠菌得培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20?25c培養(yǎng)2-3天，上述培養(yǎng)后得新鮮培養(yǎng)物用PH7、0無菌化鈉一蛋白凍緩沖液或0、9%無菌化鈉溶液制成每1ml菌數(shù)小于100cfu(菌落形成)得菌懸液。接種黑曲霉得培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基上，20?25c培養(yǎng)5?7天，加人3?5ml0、05%(m1/ml)聚山梨酯80得pH7、0無菌化鈉一蛋白凍緩沖液或0、9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，采用適宜得方法吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)，用0、05%(ml/ml)聚山梨醋80得pH7、0無菌化鈉一蛋白月S緩沖液或0、9%£菌氯化鈉溶液制成每lml抱子

13、數(shù)量小于100cfu得抱子懸液。菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2?8C在24h內(nèi)使用。黑曲霉抱子懸液存在2?8C,在驗(yàn)證過得貯存期內(nèi)用。3、4培養(yǎng)基適用性檢查3、4、1需氧菌得計(jì)數(shù)分別取1ml得金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板.金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌在30-35C,培養(yǎng)不超過3天;白色念珠菌、黑曲霉在20-25C，培養(yǎng)不超過5天.每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)得對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。3、4、2霉菌與酵母菌得計(jì)數(shù)分別取1ml得白色念珠菌、黑

14、曲霉各菌懸液，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。在20-25C,培養(yǎng)不超過5天。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)得對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。3、4、3結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上得菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上得菌落平均數(shù)得比值應(yīng)在0、5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上得菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。3、4、4試驗(yàn)結(jié)果見表1表1加入菌種培養(yǎng)條件培養(yǎng)基菌落數(shù)cfU結(jié)論胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆陳瓊脂對(duì)照A口加工胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基/胰酪大豆月東瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基銅綠假單胞菌33C,48小時(shí)菌落形態(tài)大小于對(duì)照培養(yǎng)基上得菌落一致平均值金黃色葡萄

15、球菌平均值枯草芽抱桿菌平均值白色念珠菌23C,72小時(shí)平均值黑曲霉平均值加入菌種培養(yǎng)條件培養(yǎng)基菌落數(shù)cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基/沙氏葡萄糖瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基結(jié)論沙氏葡錮糖瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡錮糖瓊脂對(duì)照A口加工白色念珠菌23C,72小時(shí)菌落形態(tài)大小于對(duì)照培養(yǎng)基上得菌落一致平均值黑曲霉平均值結(jié)論：從以上檢測(cè)結(jié)果可知，上述批號(hào)得培養(yǎng)基適用性檢查符合要求，可用于日常產(chǎn)品檢測(cè)中得計(jì)數(shù)。驗(yàn)證人/日期：審核/日期3、5計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證3、5、1供試液彳#制備：洗脫液用0、9%馬滅菌生理鹽水，檢品液制備在10000級(jí)環(huán)境中進(jìn)行。3、5、2接種與稀釋按下列要求進(jìn)行供試液得接種與稀釋，制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液得

16、體積應(yīng)不超過供試液體積得1%為確認(rèn)供試品中得微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)得供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn).(1)試驗(yàn)組取上述制備好得供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過得供試液中含菌量不大于100cfu.(2)供試品對(duì)照組取制備好得供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。(3)菌液對(duì)照組取不含中與劑及滅活劑得相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差得原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級(jí)得供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜得方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步得處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)得抑制作用無法以其她方法消除，供試液可

17、經(jīng)過中與、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)。3、5、3抗菌活性得去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定得方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)得值小于菌液對(duì)照組菌數(shù)值得50%,可采用下述方法消除供試品得抑菌活性。增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。加入適宜得中與劑或滅活劑。3、5、4微生物得回收按照6、2得計(jì)數(shù)培養(yǎng)基所用得試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)，回收試驗(yàn)采用平皿法與薄膜過濾法。3、5、4、1皿法傾注法取6個(gè)直徑90mm得無菌平皿。2個(gè)分別注入照上述“試驗(yàn)組”制備得供試液1m1；2個(gè)分別注入照上述“供試品對(duì)照組”制備得供試液1ml;2個(gè)分別注入照上述“

18、菌液對(duì)照組”制備得供試液1ml。每個(gè)平皿注入1520ml溫度不超過45c熔化得胰酪大豆陳瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻,凝固，倒置培養(yǎng).3、5、4、2平皿法試驗(yàn)結(jié)果見表2表2一次性包皮環(huán)切縫合器樣品1一次性包皮環(huán)切縫合器樣品1一次性包皮環(huán)切縫合器樣品1沖擊-次263025沖洗二次042沖洗三次000沖洗四次000回收率100%88、3%92、6%平均回收率93、7%修正系數(shù)1、07結(jié)論：以上產(chǎn)品各做三套平均回收率達(dá)80%Z上，一次回收率達(dá)到要求。正常試驗(yàn)中可采用沖片次后*回收系數(shù)進(jìn)行估算.試驗(yàn)人/日期：審核/日期3、5、4、3薄膜過濾法薄膜過濾法所采用得濾膜孔徑應(yīng)不大于0、45仙m,直徑一般為50mm若采用其她直徑得濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)得調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物得充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜得方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后得完整性。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上得微生物受損傷.取照上述“試驗(yàn)組”、“供試品對(duì)照組”與“菌液對(duì)照組”制備得供試液適量（-般取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2得供試品，若供試品中所含得菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情