沈陽地區(qū)不同人群HCV感染及HCV基因型分布研究

1、    沈陽地區(qū)不同人群HCV感染及HCV基因型分布研究黃芬1董亞珞2王占英1趙桂珍1李穎1蘇德元1 摘要應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，檢測沈陽地區(qū)3 902例不同人群血清的抗-HCV，并應(yīng)用引物特異PCR法對其中100例血清標本進行HCV基因分型。結(jié)果：正常人群抗-HCV陽性率為0.42%1.66%；輸血后及散發(fā)性肝炎(除外HAV、HBV、EBV、CMV感染)、乙型肝炎、肝炎后肝硬化(除外HBV感染)、原發(fā)性肝癌等組抗-HCV陽性率顯著高于無輸血史的非肝病病人組(P< 0.01)；100例血清標本中HCV-型感染占58%、HCV-型27%、/混合型14%

2、、未分型1%，正常人群HCV感染者中HCV基因型以型為主(80%)，丙型肝炎后肝硬化病人HCV基因型以型為主(91.7%)。提示：各類肝病病人是HCV感染的高危人群；沈陽地區(qū)HCV感染以型為主，其次為型及/混合型，HCV基因型可能與丙型肝炎病情輕重有關(guān)。 關(guān)鍵詞HCV感染HCV基因型 Study on HCV Infection and the Distribution of HCV Genotypes in Different Populations in Shenyang Area Huang Fen*,Dong Yaluo,Wang Zhanying,et al.* Department

3、 of Infectious Disease,The Second Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang 110003 Abstract3 902 serum samples in different populations were tested for anti-HCV by ELISA.Among 100 samples of them,genotypes of HCV were detected by PCR with type-specific primers.The results showed:a)anti-H

4、CV positive rates in general populations were 0.42%-1.66%;b)anti-HCV positive rates in the group of post-transfusion hepatitis and sporadic hepatitis (excluding HAV,HBV,EBV,CMV infection),hepatitis B post hepatitis cirrhosis (excluding HBV infection) and primary hepatocarcinoma were significantly hi

5、gher than the group of patients without liver diseases or the group of patients without transfusion (P< 0.01); c) in HCV genotyping,HCV-,HCV-,/ mixed type were 58%,27%,14% respectively.The rate of infection with HCV- was 80% in normal population but 91.7% with type HCV in the group of patients wi

6、th cirrhosis.These results suggested:(1)patients with different liver diseases were under high risk of HCV infection;(2)type HCV- was predominant followed by HCV- as well as / mixed in HCV genotype distribution of Shenyang area.Different genotypes of HCV might be related to the severity of hepatitis

7、 C. Key wordsHCV infectionHCV genotypes 丙型肝炎病毒(HCV)感染的分布呈全球性，自然人群中HCV感染率為0.7%3.1%1，不同地區(qū)HCV感染率有較大差別。近年來發(fā)現(xiàn)HCV變異較大，存在多種基因型，HCV不同基因型與HCV感染的地區(qū)分布、臨床表現(xiàn)、治療及轉(zhuǎn)歸可能具有某種相關(guān)性。為了解沈陽地區(qū)不同人群中HCV感染狀況及HCV基因型分布情況，為今后本地區(qū)HCV疫苗的研制和臨床治療等提供依據(jù)，我們于1991年10月1996年6月對本地區(qū)正常人群及不同類型肝病病人血清抗-HCV及HCV基因型分布進行研究，結(jié)果報告如下。 材料與方法 一、研究對象：3 902例血

8、清標本分別采自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)院門診健康體檢者、血庫獻血員及住院患者。其中大學(xué)師生475人，男243人，女232人，平均年齡23.6歲(1654歲)；妊娠婦女1 772人，平均年齡25.8歲(2236歲)；醫(yī)務(wù)人員688人，男174人，女514人，平均年齡37.6歲(2271歲)；正常獻血員423人，男300人，女123人，平均年齡28.2歲(2043歲)，以上人群血清ALT均正常，并無輸血史。122例輸血后肝炎及92例散發(fā)性肝炎(病原學(xué)檢查均除外HAV、HBV、EB病毒及巨細胞病毒感染)、28例HA、181例HB、21例肝炎后肝硬化(除外HBV感染)的診斷符合1990年8月衛(wèi)生部頒

9、發(fā)的中華人民共和國傳染病防治法規(guī)定管理的傳染病診斷標準。100例原發(fā)性肝細胞癌病人依據(jù)B超、核磁共振和甲胎球蛋白定量等診斷，其中25例經(jīng)病理證實。并選擇104例無輸血及血制品史非肝病病人做為對照組。收集血清標本-70冰箱保存，統(tǒng)一檢測。 二、HCV基因分型引物：HCV Core基因區(qū)分型PCR引物由中國科學(xué)院上海生物工程研究中心合成，其核酸序列如下： 型共同性引物： P1正義鏈5"-CGCGCGACTAGGAAGACTTC-3"(nt 139158)；P2反義鏈5"-ATGTACCCCATGAGGTCGGT-3"(nt 391410)。 型特異性引物：P

10、3正義鏈5"-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3"(nt 148167)；P4反義鏈5"-TGCCTTGGGGATAGGCTGAC-3"(nt 185204)(HCV-)；P5反義鏈5"-GAGCCATCCTGCCCACCCCA-3"(nt 272291)(HCV-)；P6反義鏈5"-CCAAGAGGGACGGGAACCTC-3"(nt 302321)(HCV-)；P7反義鏈5"-ACCCTCGTTTCCGTACAGAG-3"(nt 251270)(HCV-)。 三、檢測試劑： 1.抗

11、-HAV IgM、乙肝血清學(xué)標志物、抗-HCV檢測試劑盒由臺灣龍華生物科技公司提供，抗-HCV試劑盒為第二代產(chǎn)品，包被的抗原為C100-3、C33c、C22抗原。 2.PCR-HCV檢測試劑盒由溫州伊利康生物技術(shù)有限公司提供。 3.HCV基因分型所用逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)、Taq酶、RNA酶抑制劑(RNasin)均為Promega公司產(chǎn)品。 四、檢測方法： 1.抗-HAV IgM、乙肝血清學(xué)標志物和抗-HCV應(yīng)用ELISA方法檢測，HCV RNA應(yīng)用RT-PCR法檢測，檢測及結(jié)果判定均嚴格按試劑說明書進行。 2.HCV基因分型法：參照Okamoto2引物特異PCR法并加以改進。主要步驟為提取

12、血清總RNA；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后即接以HCV型共同性引物行第一輪PCR擴增；以HCV型特異性引物行第二輪擴增；以6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PCR終產(chǎn)物，HCV-、型的擴增產(chǎn)物長度分別為57bp、144bp、174bp及123bp。 結(jié)果 一、不同組正常人群抗-HCV陽性率：大學(xué)師生、妊娠婦女、醫(yī)務(wù)人員及獻血員抗-HCV陽性率分別為0.42%(2/475)、0.96%(17/1772)、0.58%(4/688)及1.66%(7/423)，各組間比較經(jīng)2檢驗差異均無顯著性(P>0.05)。 二、各類肝病病人抗-HCV陽性率：除甲型肝炎外，各類肝病病人抗-HCV陽性率與104例無輸血或血制品

13、史的非肝病病人比較差異均有顯著性(P< 0.01)，輸血后肝炎(除外HAV、HBV、EBV、CMV感染)抗-HCV陽性率顯著高于散發(fā)性肝炎(除外HAV、HBV、EBV、CMV感染)(P< 0.01)見表1。 三、乙型肝炎病人輸血史與抗-HCV的關(guān)系： 181例乙肝病人中， 有輸血及血制品史者56例 ， 抗-HCV 陽 性 33 例 ， 陽性率58.9%；而無輸血或血制品史者125例，抗-HCV陽性5例，陽性率4.0%，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)。 表1各類肝病病人抗-HCV陽性率 組別 檢測數(shù) 陽性數(shù) 陽性率(%) 輸血后肝炎組 122 109 89.3* 散發(fā)性

14、肝炎組 92 34 37.0* 肝炎后肝硬化組 21 16 76.2* 甲型肝炎組 28 0 0 乙型肝炎組 181 38 21.0* 原發(fā)性肝癌組 100 16 16.0* 非肝病病人組 104 2 1.9 *與非肝病病人組比較2檢驗P< 0.01；與散發(fā)性肝炎組比較2檢驗P< 0.01 四、HCV基因分型結(jié)果：3 902例不同人群血清抗-HCV陽性者243例，其中HCV RNA陽性者179例(73.7%)。隨機對其中100例抗-HCV及HCV RNA均陽性的血清標本進行HCV基因分型。結(jié)果表明：HCV-型58例(58%)、HCV-型27例(27%)、/混合型14例(14%)、未

15、分型1例(1%)，不同人群中HCV基因型總體分布差異無顯著性(P>0.05)，但正常人群中HCV-型感染率(80%)顯著高于丙肝后肝硬化組(P< 0.05)，HCV-型感染率顯著低于丙肝后肝硬化組(P< 0.05)，見表2。 表2不同人群中HCV基因型分布* 組別 檢測 例數(shù) 型 例數(shù)(%) 型 例數(shù)(%) /混合型 例數(shù)(%) 未分型 例數(shù)(%) 正常人群 5 1(20) 4(80) 輸血后丙肝 47 24(51.1) 13(27.7) 9(19.1) 1(2.1) 散發(fā)性丙肝 20 11(55) 7(35) 2(10) 乙丙雙重感染 10 5(50) 2(20) 3(30

16、) 丙肝后肝硬化 12 11(91.7)* 1(8.3) 原發(fā)性肝癌 6 6(100) 合計 100 58(58) 27(27) 14(14) 1(1) *經(jīng)R×C表的2檢驗差異無顯著性2=22.3,P>0.05 *與正常人群及輸血后丙肝組比較，經(jīng)2檢驗差異有顯著性，P< 0.05 與丙肝后肝硬化組比較經(jīng)2檢驗差異有顯著性，P< 0.05 討論 一、檢測4組不同正常人群血清抗-HCV的結(jié)果表明，沈陽地區(qū)正常人群抗-HCV陽性率平均為0.89%(0.42%1.66%)。獻血員抗-HCV陽性率較高，是大學(xué)師生組的3.95倍，但4組間無統(tǒng)計學(xué)差異。醫(yī)務(wù)人員經(jīng)常接觸病人的血

17、液及分泌物，HCV感染率(0.58%)并不高于其他正常人群，說明醫(yī)務(wù)人員并非HCV感染高危人群。但是4名抗-HCV陽性的醫(yī)務(wù)人員均有針刺損傷史，而無輸血或血制品史，其家庭成員抗-HCV均陰性。其中2名外科醫(yī)生手術(shù)中多次刺傷；1名護士曾在人工腎室工作1年余，經(jīng)常接觸血液。提示該4名醫(yī)務(wù)人員可能由于工作中接觸病人的血液或體液而感染HCV。因此醫(yī)務(wù)人員應(yīng)采取適當防護措施。 二、各類肝病病人血清抗-HCV檢測結(jié)果表明，除外HAV、HBV、EBV及CMV感染的輸血后肝炎89.3%和散發(fā)性肝炎37%是由HCV引起，輸血后肝炎抗-HCV陽性率顯著高于散發(fā)性肝炎，此外76.2%的除外乙肝的肝炎后肝硬化由HCV

18、引起。提示HCV是輸血后肝炎和非乙型肝炎后肝硬化的主要病因，是散發(fā)性肝炎的常見病因，輸血或血制品是感染HCV的主要途徑，與國外文獻報道一致3。100例原發(fā)性肝癌(HCC)抗-HCV陽性率為16%，明顯高于對照組，表明HCC與HCV關(guān)系密切。資料表明4發(fā)達國家HCC患者HCV感染率多數(shù)超過50%，提示發(fā)達國家HCC的主要病因可能是HCV。我國HCC患者中抗-HCV陽性率7.5%42.9%，存在明顯的地區(qū)差異，提示我國HCV感染可能不是HCC的主要病因。本研究中HCC患者抗-HCV陽性率16%，而過去我們檢測HCC患者單純乙肝標志物陽性者占70%，提示目前在本地區(qū)引起原發(fā)性肝癌的主要病毒性因素仍是

19、HBV感染。本文結(jié)果表明，除甲型肝炎外，各類肝病病人均為HCV感染高危人群。國外報道6%17.4%的慢性乙肝病人重疊HCV感染5，本組乙肝病人重疊HCV感染率高達21%，有輸血或血制品史者，抗-HCV陽性率明顯高于無輸血或血制品史者，說明HBV重疊HCV感染主要是由于乙肝病人在治療過程中輸血或血制品所致。我們認為，除了檢測抗-HCV篩選獻血員外，應(yīng)嚴格掌握乙肝病人輸血或血制品的適應(yīng)癥，以減少重疊HCV感染的機會。 三、沈陽地區(qū)HCV基因型分布。目前證實全世界HCV基因型至少有12種，廣泛分布的有5個基因型：/1a、/1b、/2a、/2b和/3a型。HCV不同基因型在地理分布上有較大差異。美國以

20、型為主，日本以型為主，我國也以型為主，其次為型。杜紹財?shù)?報道北京、武漢、廣州、西安、重慶、廣西等地區(qū)HCV感染均以型為主，這些地區(qū)中北京型感染率最高(19%)，廣州/混合型感染率最高(9%)。本研究結(jié)果表明沈陽地區(qū)HCV感染以型為主(58%)，其次為型(27%)，/混合型感染亦不少見(14%)，提示本地區(qū)型及/混合型感染較其它地區(qū)高，因此今后本地區(qū)HCV感染的病原學(xué)診斷、臨床治療、疫苗研制等研究，除應(yīng)著重針對型病毒進行外，不應(yīng)忽視型及/混合型。 從總體來看，HCV基因型在不同人群中分布差異無顯著性，但正常人群(血清ALT正常)的HCV感染者中HCV基因型以型為主(80%)，丙肝后肝硬化病人H

21、CV基因型以型為主(91.7%)，提示HCV-型感染肝損傷重，HCV-型感染肝損傷輕，HCV基因型與丙肝病情輕重有關(guān)，與國外文獻報道一致7，8。 本研究中未檢出HCV-型及型，1例病人血清標本經(jīng)多次PCR檢測HCV RNA均陽性，經(jīng)2次HCV基因分型檢測均未分型，表明本地區(qū)可能還存在其它基因型，有待今后進一步研究。 參考文獻 1 莊輝.病毒性肝炎流行病學(xué)研究進展.見：鄭錫文，主編.流行病學(xué)進展.第8卷.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1995.73. 2 Okamoto H,Sugiyama Y,Okada S,et al.Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers:application to clinical surveys and tracing infectious sources.J Gen Virol,1992,73673. 3 Di